We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

Cultura 1. Cella <ol><li> Trasformare le opportune cellule di lievito auxotrofi, come Try467 (Tabella 2), con un plasmide contenente (a) un URA3 -degron fusione e (b) un indicatore metabolico aggiuntivo per la selezione plasmid e manutenzione. NOTA: Un esempio di un plasmide adatto è YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV) Questo è un plasmide integrativo di lievito contenente una proteina di fusione comprendente Deg1 - un degron derivato dalla trascrizione di lievito. fattore Mat2 17, FLAG epitopo - per il rilevamento mediante immunoblotting, Vma12 - una proteina stabile ER, e URA3 15,18 (Figura 3A). (Per plasmidi utilizzati in questo studio e per ulteriori esempi di plasmidi adatti Vedere la Tabella 3). </li><li> Per la selezione plasmide e la manutenzione, mantenere le cellule in piastre di agar in un sintetico adatto Defined (SD) medium privo di marcatori di selezione amino acidi <sup&gt; 19 (ad esempio, Deg1 -UV è selezionato e mantenuto sotto SD-LYS terreni selettivi). </li><li> Grow cellule O / N a 30 ° C in un mezzo selettivo SD adatto per la manutenzione plasmide fino al raggiungimento di una fase stazionaria. Far crescere le cellule in provette o in una piastra a 96 pozzetti, a seconda del numero di campioni da esaminare (sezione 2). </li></ol> 2. Preparazione delle cellule per l&#39;analisi <ol><li> Quando un piccolo numero di campioni (N≤15) sono da dosare, diluire le cellule e sostituire il mezzo come segue: <ol><li> Diluire 50 ml di cellule da un / cultura N O con 150 ml di SD media per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti (fondo chiaro). Nota, il primo campione è designato come vuota contiene solo medio. </li><li> Determinare i valori di OD 600 dei campioni nella piastra a 96 pozzetti utilizzando un lettore di micropiastre. </li><li> Calcolare il diametro effettivo 600 in ciascun pozzetto moltiplicando il valore OD 600 per il fattore di diluizione (x4), da which il valore della lettura vuota viene sottratto. Normalizzare i valori ottenuti dividendo per 0,55 per ottenere un percorso di lunghezza calcolata di 1 cm secondo la legge di Lambert-Beer. Nota, questo valore è costante durante la misurazione del diametro esterno 600 di 200 microlitri di cellule in una piastra da 96 pozzetti standard. </li><li> Il volume esatto necessario per ottenere cellule di lievito in quantità equivalente ad OD 600 di 0,25 e trasferirlo in una provetta Eppendorf. </li><li> Centrifugare le cellule ad alta velocità (12.000 xg) per 1 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno selettivo appropriato (vedere paragrafo 3.1) per ottenere OD 600 di 0,25. </li><li> Trasferire 200 ml di ceppi diluiti in un pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Quando un gran numero di campioni (N&gt; 15) sono da esaminare, diluire le cellule e sostituire il mezzo senza preventiva OD 600 di misura, come segue: <ol><li> Trasferire 10 ml di cellule stazionarieadulto O / N in una piastra a 96 pozzetti in una nuova piastra a 96 pozzetti contenenti 190 ml (diluizione 1:20) dei terreni selettivi appropriati (vedere paragrafo 3.1). </li></ol></li></ol> 3. Cinetica di crescita in coltura liquida In condizioni selettive (Gils) <ol><li> Utilizzare i seguenti supporti per le misure di crescita con il giornalista URA3-degron: <ol><li> Per i controlli positivi di crescita del lievito in condizioni non restrittive, uso plasmide supporto SD selettivi (vedere paragrafo 1.2). Se non è richiesta la selezione plasmide, per esempio, quando si utilizza un plasmide integrativo come Deg1 -UV, medio SD contenente tutti gli aminoacidi necessari (SD completo) può essere utilizzato. </li><li> Per i campioni sperimentali di misura della crescita in condizioni restrittive, utilizzare SD-URA medio. </li></ol></li><li> Impostare un lettore di micropiastre multimodale a:. Una temperatura di incubazione di 30 ° C, OD 600 intervalli di misurazione di 15 minuti, e un cicli orbitali e lineari agitando di 1 min ogni sette min &lt;br /&gt; NOTA: Questo dual-mode agitazione è stato ottimizzato per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule; tuttavia, altri modi di agitazione o addirittura nessun scuotimento può funzionare così. </li><li> Incubare le cellule a 30 ° C in un lettore di micropiastre O / N o finché le cellule hanno raggiunto la fase stazionaria (12-24 ore). </li><li> Esportare i dati grezzi in un file di foglio di calcolo. </li><li> Determinare la cinetica di crescita del lievito utilizzando MDTcalc, un software personalizzato che calcola il tempo minimo (in ore) per le cellule di raddoppiare il loro numero di abitanti (minimo tempo di raddoppio (MDT), per dettagli vedere paragrafo 4). </li></ol> 4. Calcolo del minimo tempo di raddoppiamento (MDT): Principi dell&#39;algoritmo MDTcalc NOTA: Principi dell&#39;algoritmo MDTcalc, utilizzando un campione rappresentativo di cellule di lievito Try467 (Tabella 2) derivate in SD multimediale completa, sono illustrati nella Tabella 1 e Figura 1, che mostra un foglio di calcolo di dati e di crescita trame, respecmente. <ol><li> Sottrarre OD 600 valori vuoti, ottenuti nella rispettiva bene, da ciascuno dei valori ottenuti nel pozzetto. Dividere le differenze risultanti da 0,55 (per piastre a 96 pozzetti) per correggere la lunghezza del percorso ottico. Tracciare i valori finali (Tabella 1, Trans.) Contro il tempo per produrre la curva di crescita del lievito effettiva (OD 600 / h) (Figura 1A). </li><li> Calcolare log 2 (OD 600) per ciascuno dei valori trasformati per convertire la fase di crescita logaritmica in una curva lineare (Figura 1B). </li><li> Calcolare la pendenza di un intervallo di 10 punti temporali (N = 10) a partire dal tempo 0 e spostando contemporaneamente punto alla volta fino a N &lt;10 (Tabella 1, Slope; Figura 1C). </li><li> Calcolare il valore inverso di ciascuna pista per ottenere il tempo richiesto per la popolazione cellulare di raddoppiare (Tabella 1, 1 / pendenza; Figura 1C). Calcolare il minimo1 / valore di pendenza per determinare la MDT (Tabella 1, rettangolo nero; Figura 1C). Estrarre il MDT calcolato per le cellule nel campione (Tabella 1, 1 / Slope, rettangolo nero) dal l&#39;intervallo di tempo selezionato (tabella 1, delineato dal rettangolo rosso, figure 1B, 1D). NOTA: Il tasso di crescita delle cellule su SD-URA media è inversamente proporzionale alla MDT. </li></ol> 5. Uso MDTcalc <ol><li> Copiare i file di programma integrati in una determinata cartella sul computer. </li><li> Assicurarsi che il file di foglio di calcolo contenente i dati di crescita viene salvato e chiuso. Aprire il programma applicativo MDTcalc per vedere l&#39;inizio viene visualizzata la schermata. <ol><li> Inserire le informazioni richieste, come mostrato nella Figura 2: <ol><li> Sotto &#39;Percorso file&#39;, cliccare sul rettangolo a destra per individuare il file di foglio di calcolo. </li><li> Sotto &#39;nome foglio&#39;, scrivere il nome del foglio elettronico dove tegli dati grezzi si trova. </li><li> Sotto &#39;Posizione di partenza&#39;, inserire la coordinata foglio di calcolo del tempo 0 del primo campione. </li><li> Sotto &#39;Tempo colonna&#39;, inserire la lettera che definisce la posizione della colonna punto di tempo (tempo dovrebbe essere fornito in secondi). </li><li> Sotto &#39;colonna vuota&#39;, inserire la lettera che definisce la posizione della colonna vuota (solitamente, ma non necessariamente in A1 della piastra a 96 pozzetti). </li><li> Sotto &#39;valore OD&#39;, scegliere la trasformata OD 600 valore minimo richiesto per l&#39;avvio di calcolo MDT (di solito ,15-0,25). L&#39;impostazione di questo valore previene i calcoli di MDT per le colture in fase di latenza a causa di eccessiva diluizione in modo da MDT viene calcolato solo per i campioni che raggiungono il valore definito OD 600 o superiore. </li></ol></li><li> Una volta inserito l&#39;ultimo valore, premere il pulsante &#39;Calcola&#39; nella parte inferiore dello schermo. Assicurarsi che la barra di avanzamento sulla destra cambia gradualmente green. Non aprire il file di foglio di calcolo durante il processo di calcolo. </li><li> Esporta le due serie di dati che appaiono automaticamente sullo schermo al completamento del calcolo MDT in un foglio. Assicurarsi che i dati includono: (a) il valore MDT per ogni bene che supera il test minimo valore OD (come indicato nella sezione 5.2.1.6) e (b) il punto di tempo iniziale dell&#39;intervallo da cui la MDT è stato calcolato (Inizio tempo). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li><li>Willems, A. 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R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT&#945;2+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Degradation signal masking by heterodimerization of MAT&#945;2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility.">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li><li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates.">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li><li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes.">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., &amp; Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. 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Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li><li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms:+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast.">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li><li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope/endoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation.">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li><li>Ravid, T., Kreft, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family.">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics.">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li><li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui si descrive un saggio basato sulla crescita delle cellule per la determinazione del tasso di degradazione delle proteine ​​relativi, definiti &quot;la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettiva&quot; (Gils). Il test Gils ha diversi vantaggi: è semplice da configurare, l&#39;acquisizione dei dati e l&#39;analisi è semplice ed è estremamente modulare. Di conseguenza, Gils può essere applicata contemporaneamente a più campioni in un facile da usare formato di piastra multi-bene che può es...

Il sistema di degradazione ubiquitina-proteasoma è una grande macchina di regolamentazione, che è stata implicata nel mantenimento dell&#39;omeostasi delle proteine ​​in tutti gli eucarioti. Il gruppo di continuità coniuga inizialmente più molecole di ubiquitina ad una proteina bersaglio dopo che la proteina poli-ubiquitina-tag è degradata dal proteasoma 26S. Nella maggior parte dei casi, il fattore limitante per l&#39;ubiquitina mediata degradazione è ubiquitinazione substrato, mediato da E2 coniugando enzimi e E3 legatura enzimi (E3 ligasi) 1. Di conseguenza, la stabilità intracellulare di specifiche proteine ​​riflette la loro suscettibilità alla ubiquitina-coniugazione e l&#39;attività dei loro enzimi ubiquitinazione affini. Ligasi E3 sono i componenti di riconoscimento del substrato principali del gruppo di continuità. Come tali, questi enzimi riconoscono degrons nei loro substrati che sono o assenti o non esposto nelle loro controparti stabili 2. Per esempio, molti regolatori del ciclo cellulare must essere sintetizzato e degradato in maniera temporalmente specifico al fine di mantenere la progressione del ciclo cellulare in ordine. La degradazione di queste proteine ​​è spesso controllata dalla fosforilazione, mediata da cellule di segnalazione chinasi regolate 3,4. D&#39;altra parte, le proteine ​​aberrante piegati sono riconosciuti attraverso degrons criptici. Si tratta di regioni che normalmente sono nascosti nella struttura nativa e sono esposti su struttura perturbazione. Tali degrons comprendono domini idrofobici 5-7 e segmenti intrinsecamente disordinati 8. Dalla scoperta fondamentale della ubiquitina-sistema di degradazione delle proteine ​​e la caratterizzazione dei suoi fondamentali nei lisati di reticolociti 9, genetica del lievito è stato determinante nella scoperta molti dei componenti del sistema ubiquitina 10. Il successo di lievito come organismo modello per l&#39;analisi sistematica della degradazione proteica dal gruppo di continuità è dovuto principalmente al fatto che il gruppo di continuità è altoly conservato in tutti gli eucarioti 4, unita alla loro riconducibilità come sistema sperimentale. In effetti, i sistemi a base di lievito sono comunemente impiegati per decifrare i meccanismi di azione della macchina ubiquitinazione. Studiando proteina degradazione mediante biochimici solito richiede la preparazione di estratti cellulari. Mentre le proteine ​​cellulari animali possono essere estratti in condizioni relativamente blande che conservano le interazioni e la funzione della proteina, la presenza di una parete cellulare robusto in lievito 11 richiede condizioni perturbazione considerevolmente più dure che possono influenzare il recupero delle proteine. In effetti, diverse modalità di rottura delle cellule di lievito variano notevolmente nella loro capacità di recuperare proteine ​​intatte in quantità che rappresentano correttamente la loro abbondanza relativa cellulare. Ulteriore inesattezza è inerente i diversi metodi utilizzati per la determinazione del tasso di degradazione di proteine ​​specifiche: a base di etichettatura relativa ad esperimenti metabolici &quot;pulse-chase&quot; seguita da immunoprecipitation, per isolare proteine ​​specifiche 12, spesso non è strettamente quantitativo. Così, quando la degradazione delle proteine ​​viene confrontato con questo metodo, estrema cautela deve essere esercitata nell&#39;interpretazione dei risultati. Per ovviare a questo inconveniente, un cicloesimmide alternativa (CHX) test inseguimento può essere impiegato 12. In questo saggio, l&#39;inibitore di traduzione è aggiunta a colture cellulari e cambiamenti temporali nei livelli di proteine ​​allo steady-state vengono successivamente monitorati. Tuttavia, l&#39;utilizzo di CHX è limitato alle proteine ​​con emivite relativamente brevi (&lt;90 min), l&#39;inibizione a lungo termine della sintesi proteica è citotossico. In particolare, entrambi i saggi suddette richiedono l&#39;uso di anticorpi specifici per proteine ​​che non sono sempre disponibili. Per superare queste limitazioni tecniche, i ricercatori hanno sviluppato diversi approcci che non richiedono l&#39;estrazione delle cellule e la manipolazione diretta di proteine. Un approccio si basa sulla creazione di yea auxotrophicceppi st, ottenuti per delezione di geni codificanti enzimi metabolici essenziali. Tali geni includono HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, codifica per gli enzimi necessari per la biosintesi degli aminoacidi, così come URA3 che codifica OMP decarbossilasi (URA3), un enzima essenziale della pirimidina ribonucleotide biosintesi. URA3 è stato ampiamente utilizzato in studi di degradazione proteica. In questi test, espressione costitutiva di URA3 salva la crescita delle cellule URA3 in uracile con deficit medio 13. Di conseguenza, destabilizzare URA3 attraverso la fusione di un degron può ridurre la crescita delle cellule su terreno minimo privo di uracile. Questo metodo è stato utilizzato in diversi studi di degradazione delle proteine, compresa l&#39;individuazione di degrado determinanti 5, E3 ligasi 14 e ubiquitinazione ausiliario fattori 15 e la scoperta di nuovi UPS degrons 16. Tutti questi metodi impiegati crescita cellulare su piastre di agar come test di lettura. Tuttavia, tche il criterio di crescita (crescita positivo / negativo), mentre la robusta ed efficiente, è per lo più qualitativa e non fornisce informazioni quantitative che è importante per valutare la potenza di un degron o il contributo relativo dei diversi fattori di degrado ausiliari. Abbiamo quindi messo a punto e utilizzato vettori di lievito e metodi di screening che consente un&#39;analisi sistematica e quantitativa di degradazione delle proteine ​​da parte del URA3 -degron sistema di fusione. Il protocollo si basa su un saggio di facile impugnatura che misura la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettive (Gils) e sulla generazione delle curve di crescita standard. Cinetica di crescita del lievito sono caratterizzate da tre fasi principali - il ritardo, l&#39;esponenziale (log) e la fase stazionaria. Calcolo della cinetica di replicazione del lievito durante la fase log in condizioni selettive, che è determinata dai livelli di espressione della URA3-degron, fornisce un imparziale misurazione quantitativa of degradazione delle proteine. Questo metodo può essere applicato a misurare e comparare i tassi di degradazione di substrati multipli UPS contemporaneamente in più ceppi e in diverse condizioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:184px;">Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td rowspan="6" style="width:339px;">For yeast growth on SD minimal media.&#160; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>16325</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino acids</td>
			<td>Highest purity available&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">96 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">167008</td>
			<td>Any other compatible brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Cyclohexamide&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Sigma - Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>Working conc. 0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Infinite 200 PRO series</td>
			<td style="width:149px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">MDTcalc</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Experimental software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

Proteina degradazione da parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è un importante meccanismo di regolazione per le proteine ​​omeostasi in tutti gli eucarioti. L&#39;approccio standard per la determinazione intracellulare degradazione delle proteine ​​si basa su test biochimici per seguire la cinetica di declino proteine. Tali metodi sono spesso laboriosa e che richiede tempo e quindi non suscettibili di esperimenti volti a valutare diversi supporti e condizioni di degrado. In alternativa, sono stati sviluppati saggi di crescita a base di cellule, che sono, nel loro formato convenzionale, saggi end-point che non può determinare quantitativamente relativi cambiamenti nei livelli di proteina. Qui si descrive un metodo che determina fedelmente le variazioni dei tassi di degradazione delle proteine ​​da loro accoppiamento con lievito cinetica di crescita delle cellule. Il metodo si basa su un sistema di selezione stabilito dove uracile Auxotrofia di URA3 -deleted cellule di lievito viene salvato da una proteina reporter esogena espressa, Composto da una fusione tra il gene URA3 essenziale e determinante degradazione (degron). La proteina reporter è progettato in modo che la sua velocità di sintesi è costante mentre la sua velocità di degradazione è determinata dal degron. Come la crescita delle cellule in terreno uracile-carente è proporzionale ai relativi livelli di URA3, cinetica di crescita sono del tutto dipendenti dalla degradazione delle proteine ​​giornalista. Questo metodo di misura con precisione variazioni di intracellulari cinetica di degradazione delle proteine. E &#39;stato applicato a: (a) valutare il contributo relativo dei fattori-ubiquitina coniugare note alla proteolisi (b) E2 coniugare enzima struttura-funzione analizza (c) Identificazione e caratterizzazione di nuovi degrons. L&#39;applicazione del sistema basato URA3 degron- trascende campo degradazione delle proteine, come può anche essere adattato ai cambiamenti di monitoraggio dei livelli di proteine ​​associate con funzioni di altre vie cellulari.

Indagare il ruolo degli enzimi della via Doa10 nella degradazione di un substrato giornalista Per verificare la validità del metodo Gils è stato confrontato con un saggio degrado tradizionale. Questo esperimento valuta il contributo relativo di componenti della membrana ER-localizzato Doa10 E3-ligasi complessa 20,21 alla degradazione del substrato giornalista controllo di qualità delle proteine ​​Deg1- VU (Figura 3A). Il plasmide <...

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Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Video: Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Ricerca

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

Un sistema di co-coltivazione idroponica per l&#39;analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari e della segnalazione delle piante / microbe

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione