Il significato del protocollo si basa sulla segnalazione da membrana a nucleo e non influisce direttamente sul genoma, come nel caso delle cellule staminali pluripotenti indotte. La natura non teratogena delle cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue è il principale vantaggio della tecnica, rendendola adatta per un'applicazione clinica sicura in vari campi della medicina rigenerativa. A dimostrare la procedura sono la dott.ssa Anne-Kathrin Schott, responsabile del progetto, e Oksana Greenacre, assistente di laboratorio nel mio laboratorio.
Per isolare i PBBC, aggiungere 25 millilitri di sangue uno a uno diluito con PBS a 10 millilitri di mezzi gradienti di densità e centrifugare la miscela a 300 volte G per 30 minuti. Isolare il livello dell'interfaccia tra il plasma e il supporto del gradiente di densità pipettando. Lavare le cellule isolate con cinque millilitri di PBS sterile e centrifuga a 300 volte G per 10 minuti.
Dopo aver ripetuto la procedura due volte, contare il numero di celle utilizzando una camera di conteggio. Aggiungere 6 per 10 alla 6a cellule mononucleari a un tubo da 15 millilitri, quindi eseguire il cross-linking anticorpale aggiungendo anticorpi specifici della proteina della membrana legati alla GPI umana alle cellule in PBS con 1%BSA e incubando per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo il cross-linking, sostituire il mezzo di incubazione con il Mezzo di Dulbecco Modificato di Iscove integrato con 10%FBS.
Far crescere le cellule in tubi di polistirolo da 15 millilitri posizionandole in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 8-10 giorni senza tremare. Il quinto giorno, aggiungere un ulteriore da uno a due millilitri del Mezzo di Iscove integrato con 10%FBS a ogni tubo da 15 millilitri. Contare le celle coltivate con una camera di conteggio.
Quindi centrifugare la sospensione cellulare di circa 5 per 10 alla sesta cella a 300 volte G per 10 minuti e aspirare il supernatante risultante con una pipetta Pasteur sterile. Rimescolare il pellet cellulare in 90 microlitri di PBS prerimorfosi di pH 7,2 con 0,5%BSA e due EDTA millimolare. Quindi aggiungere 80 microlitri CD-45 perline magnetiche positive di dimensioni nanometriche alla sospensione cellulare e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
Per lavare le cellule, aggiungere due millilitri di tampone PBS e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimosi le cellule in 500 microlitri di tampone PBS. Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone PBS pre-raffreddato e posizionarla nel campo magnetico.
Posizionare la sospensione cellulare sulla colonna e lavarla due volte con 500 microlitri di tampone PBS. Raccogliere le cellule nel mezzo di Iscova integrato con 1%BSA e contare le celle nella camera di conteggio. Posizionare le copertine di vetro in piatti a quattro pozzi e rivestirle con una o cinque poli-L-ornitina diluita e acqua distillata doppia.
Dopo aver incubato i coprispalla a 37 gradi Celsius per un'ora, lavarli con acqua distillata doppia. Scongelare lentamente da 0,5 a due milligrammi per millilitro di laminina e aggiungerlo alla parte superiore dei copripavimenti. Incubarli a 37 gradi Celsius per due ore, quindi rimuovere la laminina in eccesso pipettando e aggiungere il mezzo neuronale N2 ai piatti di coltura.
Cellule negative CD-45 derivate da BD in N2 medium su coverlips in vetro rivestito di ornitina laminina per due giorni in un'incubatrice con anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per avviare una differenziazione neuronale delle cellule appena generate dal BD. Successivamente, le cellule di coltura nel mezzo di differenziazione neuronale e posizionare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 16 giorni. Preparare un fissatore con 75 millilitri di acqua sterile e quattro grammi di paraformaldeide.
Aggiungere 10 idrossido di sodio normale secondo necessità mescolando fino a quando la soluzione non si sgombrato. Aggiungere la miscela di saccarosio alla soluzione e titolarla a pH 7,4 con sei normali acidi cloridrati. Portare il volume a 100 millilitri con acqua sterile.
Dopo aver rimosso il supporto dalla coltura cellulare, incubarlo con fissante prebellica per 15 minuti, quindi scartare il fissatore e lavare le cellule tre volte per cinque minuti ciascuna. Aggiungere immediatamente una soluzione tritone-X allo 0,3% appena fatta e permeabilizzare le cellule per cinque minuti. Lavare tre volte con PBS e aggiungere una soluzione di blocco di PBS e 5%BSA.
Bloccare le celle a temperatura ambiente su una piastra rocker per un'ora. Preparare un'adeguata diluizione degli anticorpi in 1%BSA PBS e incubare le cellule con gli anticorpi su una piastra rocker per 1,5 ore a temperatura ambiente. Lavare le cellule tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio.
Incubare le cellule con DAPI e montare i copripaspamenti con supporti di montaggio per la visualizzazione al microscopio. L'aspetto morfologico delle cellule didifferenziate BD è stato studiato nei giorni uno, cinque e 10, mostrando una tendenza alla graduale scomparsa delle cellule non attivate e una nuova popolazione in costante crescita di cellule in coltura attivata. Le cellule dedifenziate BD erano piccole e mostravano le caratteristiche delle cellule agranulari immature con meno organelli e grandi nuclei con cromatina condensata simile agli ESC.
Le cellule sono state studiate per la neuro-differenziazione dopo aver coltivato in piatti di coltura rivestiti di laminina per 30 giorni. Già quattro giorni, le prime cellule neuronali con lunghe strutture ramificate potevano essere rilevate. La maggior parte delle piccole cellule sferiche si sviluppavano in cellule ramificate con forme allungate più grandi, il che implica un processo attivo verso la differenziazione ai lignaggi neuronali.
Il corpo cellulare e i processi delle cellule hanno mostrato una complessità superiore rispetto alle cellule indifferenziate, presentando un'alta densità di reticolo endoplasmatico ruvido e fasci di filamenti di actina. Le cellule che crescono nei mezzi di differenziazione spesso stabilivano contatti cellula-cellula che coinvolgevano il corpo cellulare, mentre altre coinvolgevano processi cellulari in modo simile alla neurite. L'analisi immunochimica eseguita utilizzando anticorpi specifici ha confermato che le cellule dedifenziate BD sono in grado di ri-differenziarsi verso vari lignaggi neuronali, compresi gli astrociti GFAP.
Questa tecnica consente di creare cellule autologhe non teratogene in grado di ri-differenziarsi in cellule di tutti e tre gli strati germinali, aprendo nuove opportunità nella ricerca sulla medicina rigenerativa.
