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Tutte le procedure qui e nel video allegato descritti sono stati approvati dalla cura e utilizzo dei Comitati animali istituzionale del Health Sciences Center e il campus principale della University of New Mexico. 1. prenatale Etanolo Esposizione <ol><li> Ottenere tutti i materiali e le sostanze chimiche necessarie: Saccarina idrato sale di sodio, 190 etanolo prova (alcool al 95% in volume), tubi di bere vetro perline, gomma naturale bianco # 4 tappo un foro, 1 &quot;punto di curvatura tubi-ball, governanti carta stampata da www .vendian.org / mncharity / dir3 / paper_rulers /. </li><li> Ottenere provati ratti allevatore adulto da un fornitore o fonte alternativa. Utilizzare allevatori lungo Evans per i metodi ei dati rappresentativi presentati in questo protocollo. Le femmine pesano 125-150 g e 6-7 settimane di età all&#39;arrivo tale che essi sono di circa 9-10 settimane al momento della riproduzione (passo 1.5). Assicurarsi che tutti i futuri dighe sono primipare. Assicurarsi che i maschi sono 12settimane di età in arrivo e 15 settimane all&#39;inizio del protocollo allevamento. </li><li> Casa gli animali singolarmente in gabbie di plastica a 22 ° C su un rovescio 12 ore di luce / buio calendario (si accende 21:00-9:00 hr). Fornire l&#39;accesso a cibo e acqua del rubinetto ad libitum per tutto lo studio, anche durante tutte le sessioni di bere. Lasciare almeno 1 settimana per acclimatazione alla struttura prima di procedere alla fase 1.4. </li><li> Ottenere peso corporeo di base per ogni ratto femmina. </li><li> Valutare i livelli di consumo pre-gravidanza nei ratti femmina per 2 settimane. Seguire i passaggi 1.5.1-1.5.6 in ordine. <ol><li> Nei giorni 1 e 2 riempire un tubo potabile contenente 0,066% soluzione saccarina (senza etanolo) in acqua di rubinetto. Per quantificare il consumo di apporre un righello di carta con precisione mm al tubo di bere prima di riempirlo. Utilizzare questo metodo in quanto riduce gli errori in misura associata pesatura tubi per quantificare il consumo di etanolo. Riempire il tubo per i 20 mm del righello. Inizia quattro ore drinkisessioni ng (passi 1.5.1-1.5.6 e 1.7) 1 ora dopo l&#39;inizio della fase di buio (10:00 ore), quando i livelli di attività e bere sono più elevati. </li><li> Al termine di ogni sessione potabile quantificare il volume della soluzione di saccarina che è stato consumato. Per facilitare la misurazione, determinare il volume di soluzione per mm sul righello in anticipo e convertire mm volumi. Per i tubi raccomandate qui ogni mm corrisponde a 0,366 ml. </li><li> Nei giorni 3 e 4 riempire un tubo con 2,5% di etanolo (v / v) e la soluzione di saccarina 0,066% in acqua di rubinetto. Al termine di ogni sessione di quantificare la quantità di soluzione di etanolo (peso per kg di peso corporeo) che è stato consumato. </li><li> Il giorno 5 e successivamente riempire un tubo con 5% di etanolo (v / v) e la soluzione di saccarina 0,066% in acqua di rubinetto. Al termine di ogni sessione di quantificare la quantità di soluzione di etanolo (peso per kg di peso corporeo) che è stato consumato. </li><li> Al completamento della fase di pre-gravidanza potabile pesare i ratti e calcolare il consum etanolo medioption e deviazione standard per l&#39;intero gruppo. Rimuovere i ratti per il che significa il consumo è maggiore di 1 deviazione standard sopra o sotto il gruppo media dallo studio per ridurre la variabilità nel bere volontaria durante la gravidanza. </li><li> Assegnare i rimanenti ratti sia al controllo saccarina o condizioni PAE tali che i livelli bere pre-gravidanza sono abbinati il ​​più possibile per i due gruppi. </li></ol></li><li> Entro 1-14 giorni coppia ogni ratto femmina con un allevatore di sesso maschile provata. Ratti femmina non consumano etanolo durante la fase di riproduzione. Confermare la gravidanza dalla presenza di un tappo vaginale, pesare il ratto femmina, e la casa dei suoi individualmente. Questo è definito come il giorno di gestazione 1. Facoltativamente, lasciare i ratti femmina con un allevatore di sesso maschile per un massimo di 5 giorni, dopo che rimuovono le femmine dallo studio. NOTA: poiché il consumo di etanolo durante la gravidanza inizia alle 10:00 ora il gestazionale giorno 1 di ispezione per la presenza di un tappo vaginale deve essere eseguitaprima di questo tempo. </li><li> Fornire soluzioni etanolo o saccarina per 4 ore al giorno (1.000 a 1.400 ore) per la durata della gravidanza. <ol><li> A partire dal giorno di gestazione 1 forniscono il topo femmina con uno 0% o 5% di etanolo e la soluzione di saccarina 0,066% in acqua di rubinetto in base alla assegnazione di gruppo. Assicurarsi che il volume di soluzione di etanolo 0% fornito ai ratti di controllo saccarina corrisponde al volume medio di soluzione di etanolo al 5% consumata dai topi etanolo. Al termine di ogni sessione di quantificare la quantità di soluzione di etanolo (peso per kg di peso corporeo) o la saccarina che è stato consumato. </li><li> Pesare dighe ratto settimanale per valutare l&#39;aumento di peso materno. </li><li> Fornire cibo e acqua del rubinetto in ogni momento, tra cui le bevute. </li><li> Cessate le procedure di esposizione etanolo quando la prole sono nati. Registrare il numero di cuccioli vivi e pesi dei cuccioli alla nascita. Designare il giorno della nascita come postnatale giorno 0. </li><li> Abbattere la cucciolata di 10 cuccioli in giro giorno postnatale 2-3. Tentativo to mantenere una parità di rapporto maschi femmine in ogni cucciolata. Se questo non è possibile, abbattere a 10 cuccioli con un numero disuguale di maschi e femmine. </li><li> Registra pesi cuccioli 2-3 giorni dopo la nascita. </li><li> Svezzare gli animali al giorno circa 21-24 postnatale e la casa a coppie dello stesso sesso con un animale della stessa condizione trattamento prenatale. Non utilizzare più di 1-2 ratti da ogni disordine per esperimento per limitare i potenziali effetti del disordine. </li></ol></li></ol> 2. Social Behavior <ol><li> Ottenere e preparare tutti i materiali e le attrezzature necessarie. <ol><li> Ottenere un apparato per l&#39;interazione sociale. Usare una camera con una parte superiore aperta costruito di materiale facile da pulire e sterilizzare. La parte anteriore dell&#39;apparecchio deve essere coperto con plastica rigida trasparente (~ spessore 2 mm) per le riprese. Linea le pareti interne e il pavimento con plastica trasparente (~ 2 mm di spessore) per aiutare nella pulizia e controllo degli odori. Specchi svolge lungo il wa interno posteriorell per aiutare l&#39;analisi. NOTA: Per i dati rappresentativi riportati qui una camera personalizzato (95 cm di lunghezza × 47 centimetri di larghezza di altezza × 43 cm), con un top aperto e trasparente di plastica rigida (2 mm di spessore) che copre i fianchi interni e piano dell&#39;apparato è stato utilizzato. Specchi sono stati collocati lungo la parete di fondo. Le dimensioni e materiali specifici non sono critici per la misurazione del comportamento sociale, tuttavia, è consigliabile che le dimensioni essere sufficientemente grande da garantire che autentica interazione sociale può essere distinto da altri comportamenti. Cioè, l&#39;apparato deve essere abbastanza grande in modo che gli animali non sono sempre in stretta vicinanza l&#39;uno all&#39;altro. </li><li> Ottenere telecamere in grado di registrare in condizioni di luce bassa o come non tutte le riprese è condotta con illuminazione poco o nessun ambiente all&#39;interno dello spettro visibile. Assicurarsi che la fotocamera ha una risoluzione elevata nello spettro infrarosso, tuttavia, qualsiasi fotocamera in grado di registrare in condizioni di oscurità nella sua nativamodalità notte o con l&#39;aggiunta di illuminatori a infrarossi dovrebbe essere sufficiente. </li><li> Posizione illuminatori infrarossi intorno all&#39;apparecchio per migliorare l&#39;illuminazione dell&#39;apparecchio nella registrazione video. </li><li> Ottenere cippato grado di laboratorio (di chip pioppo). </li><li> Ottenere un pennello, paletta, biossido di cloro e alcool isopropilico (70%) per pulire l&#39;apparecchio tra le sessioni e controllo degli odori. </li></ol></li><li> Acclimatazione Apparato e il comportamento sociale <ol><li> Per questa fase dell&#39;esperimento, effettuare misurazioni in ratti adulti che sono almeno 90 giorni di età. </li><li> Prima di ogni sessione di rimuovere eventuali trucioli boschi, pulire l&#39;apparecchio pulito con alcool isopropilico per controllare gli odori tra le sessioni e fornire cippato fresco. Assicurarsi che i trucioli coprono interamente il fondo dell&#39;apparecchio. Pulire e disinfettare l&#39;apparato con un agente appropriato, ad esempio il biossido di cloro, come necessario. </li><li> Per tre giorni consecutivi inserire un suo compagno di gabbia degli animali e nellacamera per 30 minuti per acclimatare animali all&#39;apparecchio. Durante le sessioni di acclimatazione tutte le luci delle camere sono spente. </li><li> Alla fine della terza sessione di acclimatazione casa gli animali singolarmente in nuove gabbie con biancheria fresca, cibo e acqua per 24 ore per motivare l&#39;interazione sociale. </li><li> Record interazione sociale il giorno 24 ore dopo gli animali sono stati separati. <ol><li> Rimuovere i trucioli di legno dall&#39;apparecchio, pulito e disinfettare con biossido di cloro, pulire con alcool isopropilico per controllare gli odori, e sostituire i trucioli di legno prima della sessione. </li><li> Posizionare una o più telecamere per registrare l&#39;interazione. Posizione almeno una telecamera di fronte dell&#39;apparecchiatura in modo che gli specchi sulla parete posteriore dell&#39;apparecchio può fornire un&#39;ulteriore prospettiva per l&#39;analisi. </li><li> Recupero animali uno alla volta e tenere l&#39;animale di fronte alla telecamera in modo che le caratteristiche uniche della pelliccia modello possono notare. Questi elementi di identificazione diil pelo può essere utilizzata per distinguere ratti durante l&#39;analisi anziché marcatura artificialmente gli animali. NOTA: Poiché molti aspetti del roditore interazione sociale coinvolgono i segnali olfattivi e odorare il partner, ovunque devono essere evitati eventuali odori estranei introduzione. Ratti lunghi-Evans hanno tipicamente qualche caratteristica del modello di pellicce che può essere utilizzata per distinguere una data coppia di animali. Per altri ceppi (ad esempio, ratti Sprague-Dawley) potrebbero essere utilizzati approcci alternativi come la marcatura della coda con un colorante inodore. E &#39;importante riconoscere che molti comportamenti di interesse sono diretti verso obiettivi specifici (ad es., Anogenitale sniffing diretto vicino alla base della coda, attacchi giocose diretti alla nuca, o attacchi aggressivi diretti verso i fianchi o la pancia). Marcatura gli animali più vicino alla punta della coda lontano da questi bersagli di interesse è raccomandato. </li><li> Registrazione video della interazione sociale per almeno 12 min.</li><li> Monitorare gli animali per combattere per tutta la sessione. Se possibile, osservare gli animali tramite un monitor o finestra in modo che lo sperimentatore non è nella camera durante la sessione. NOTA: Fighting è stato solo raramente osservata in studi con ratti adulti, invece, gli animali devono essere monitorati per tutta la sessione. La sessione dovrebbe essere cessato se non vi è lotta eccessiva o vi sono segni di danni o lesioni ad un animale. </li></ol></li></ol></li><li> Codifica comportamentale e analisi. <ol><li> Identificare i seguenti comportamenti di interesse di cui al precedente lavoro con PAE 1,18. Quantificare la durata, la frequenza e la latenza di prima occorrenza dei seguenti comportamenti; wrestling (compresi pinning), pugilato, strisciando (incrocio) sopra / sotto il partner, anogenitale sniffing, altro sniffing del corpo del partner (corpo sniffing), allogrooming (grooming del partner), l&#39;allevamento, e sniffing / scavando nei trucioli di legno . Esempi di ogni comportamento sono illustrared nel componente video di questo articolo. </li><li> Quantificare i comportamenti sociali di interesse dal video. Ottenere la frequenza, la durata totale e la latenza di prima istanza per ogni comportamento di interesse. NOTA: Ottenere queste misure può essere realizzato manualmente, tuttavia, si raccomanda di quantificazione con analisi computerizzate di video digitalizzato. A Matlab (www.mathworks.com) script per la riproduzione del video e la quantificazione dei comportamenti è fornita come supplemento a questo articolo. </li><li> Dopo codifica completata per tutti i ratti i dati relativi alla durata, frequenza e latenza risultanti vengono analizzati con un pacchetto statistico. </li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Play-fighting+differs+from+serious+fighting+in+both+target+of+attack+and+tactics+of+fighting+in+the+laboratory+rat+Rattus-Norvegicus.">Play-fighting differs from serious fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rat Rattus-Norvegicus.</a> Aggressive Behav. 13 (4), 227-242 (1987).</li><li>Meaney, M. J., Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+descriptive+study+of+social-development+in+the+rat+(Rattus-Norvegicus).">A descriptive study of social-development in the rat (Rattus-Norvegicus).</a> Anim. Behav. 29 (1), 34-45 (1981).</li><li>Pellis, S. M., Pellis, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prejuvenile+onset+of+play+fighting+in+laboratory+rats+(Rattus+norvegicus).">The prejuvenile onset of play fighting in laboratory rats (Rattus norvegicus).</a> Dev. Psychobiol. 31 (3), 193-205 (1997).</li><li>Himmler, B. T., Pellis, V. C., Pellis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+the+dynamics+of+social+interactions:+measuring+play+fighting+in+rats.">Peering into the dynamics of social interactions: measuring play fighting in rats.</a> J. Vis. Exp. (71), e4288-e4288 (2013).</li><li>Panksepp, J., Siviy, S., Normansell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psychobiology+of+play+:+Theoretical+and+methodological+perspectives.">The psychobiology of play : Theoretical and methodological perspectives.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 8 (4), 465-492 (1984).</li><li>Siviy, S. M., Panksepp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+modulation+of+juvenile+play+in+rats.">Sensory modulation of juvenile play in rats.</a> Dev. Psychobiol. 20 (1), 39-55 (1987).</li><li>Pellis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+orbital+frontal+cortex+damage+on+the+modulation+of+defensive+responses+by+rats+in+playful+and+nonplayful+social+contexts.">The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and nonplayful social contexts.</a> Behav. Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).</li><li>Blanchard, R. J., Blanchard, D. C., Takahashi, T., Kelley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attack+and+defensive+behavior+in+albino-rat.">Attack and defensive behavior in albino-rat.</a> Anim. Behav. 25 (3), 622-634 (1977).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Il paradigma esposizione prenatale qui descritto comporta il consumo volontario di etanolo (5% v / v) di dighe ratto durante la gravidanza. Ci sono un certo numero di protocolli per esporre gli animali non umani a etanolo durante lo sviluppo cerebrale rappresentato in letteratura, che differiscono rispetto alla temporizzazione, dose, la durata e la via di somministrazione etanolo nonché specie in esame. Anche se uno studio approfondito dei vantaggi dei vari protocolli di esposizione non è fornito qui, numerosi vantagg...

Si stima che circa 1-5% dei bambini sono diagnosticati con Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs) 2, che comprendono la sindrome alcolica fetale (FAS), parziale FAS (PFA), e alcolcorrelati dello sviluppo neurologico Disturbi (ARNDs) 3. I deficit nel comportamento sociale e cognizione sono tra gli esiti avversi più comuni osservati nei bambini con FASDs 4-7. Conseguenze negative non sono limitati a forte esposizione prenatale (PAE), come moderato PAE che non porta al deficit morfologici, comportamentali e cognitivi cospicua caratteristica del FAS può causare relativamente sottili, ma comunque persistente, deficit negli esseri umani con FASDs 8-10 e gli animali non umani esposti all&#39;etanolo durante lo sviluppo del cervello 11. L&#39;importanza di comprendere le conseguenze neurobiologiche comportamentali e corrispondenti di moderata PAE è sottolineata da stime attuali indicano che la grande maggioranza dei casi FASD rientrano fra le meno sgamma Evere dello spettro 12. Diversi laboratori indipendenti hanno segnalato alterazioni roditore comportamento sociale legati a etanolo esposizione durante lo sviluppo del cervello, tra cui una diminuzione di indagine e di interazione 1,13-15, alterata gioco 14,16,17, aumento interazioni aggressive 17,18, alterazioni nella risposta a stimoli sociali 19-21, e deficit in preferenze alimentari socialmente acquisite e la memoria di riconoscimento sociale 22. Deficit comportamento sociale sono stati osservati a seguito dell&#39;esposizione ad pesanti (concentrazioni di etanolo nel sangue (BECS) ~ 300 mg / dl) 22,23 o livelli più moderati di etanolo (BEC ~ 80mg / dl) 1, e attraverso una vasta gamma di parametri per altro significativo fattori, tra cui i tempi di esposizione, durata dell&#39;esposizione, e l&#39;età al momento della valutazione del comportamento. Precedenti ricerche hanno dimostrato che le alterazioni in aspetti specifici di int socialeeraction in età adulta discriminare ratti esposti a livelli moderati di alcol da animali di controllo esposti a saccarina 1,18. In particolare, moderata PAE ha sempre stato associato con aumenti robusti di wrestling, che suggerisce un aumento del comportamento aggressivo, e più bassi livelli di indagine sociale (ad esempio, fiutando del partner) in età adulta. Perché alterazioni nel comportamento sociale sono conseguenze affidabili PAE, la quantificazione del comportamento sociale in seguito PAE può tenere importanza per progredire verso una più completa comprensione delle basi neurali di alterazioni PAE-correlate nel comportamento sociale e lo sviluppo di approcci interventistici. L&#39;obiettivo di questo documento e il video associato è di fornire istruzioni sul protocollo PAE moderato e metodi per la quantificazione del comportamento sociale in figli adulti che hanno affidabile distinto prenatale alcol esposti da prole non esposti rat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Saccharin sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>493538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaded glass drinking tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural rubber white #4 stopper one hole</td>
			<td>Plasticoid</td>
			<td>LSG4M181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; bend tubes-ball point</td>
			<td>Ancare</td>
			<td>TD-199-3&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper rulers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td><a href="http://www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers">www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apparatus for social interaction</td>
			<td>Custom built</td>
			<td>N/A</td>
			<td>95 cm X 47 cm X 43 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video cameras</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of recording low/no light conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared illuminators</td>
			<td>Vitek</td>
			<td>VT-IR1-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teklad laboratory grade sani-chips</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>7090A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush and dustpan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets)</td>
			<td>Quiplabs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare per manufacturer&#39;s recommendation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

moderate prenatal alcohol exposure and quantification of social behavior in adult rats

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE1, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

Nel corso di molti cicli di allevamento ratti femmina nella condizione etanolo bere costantemente una media di circa 2,1 g / kg di etanolo per 4 hr bevuta. Dighe Rat consumano circa la metà del totale di quattro ore durante il primo 15 a 30 minuti dopo l&#39;introduzione dei tubi bere, causando un picco di concentrazione di etanolo nel siero materno di circa 60 mg / dl, misurata al punto di tempo di 45 min. Il restante 3,5 ore del periodo di bere, continuano a consumare 5% di etanolo a un tasso inferiore, ma relativame...

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Moderate Prenatal Alcohol Exposure and Quantification of Social Behavior in Adult Rats

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

Moderata esposizione prenatale di alcool e quantificazione di comportamento sociale in ratti adulti

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several ...

moderate-prenatal-alcohol-exposure-quantification-social-behavior

Research

JoVE Journal

Behavior

9.6K Views.  University of New Mexico. The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood. 