Un vantaggio di questo protocollo è che il foglio del worm è facile da gestire. Il foglio ha caratteristiche che prevengono l'essiccazione, permettendoci di condurre l'irradiazione del microbeam agli animali viventi, eseguire diversi saggi comportamentali e osservazioni a lungo termine. I canali microfluidici in questo foglio di vermi sono aperti, rendendo più facile la raccolta degli animali.
Questi fogli di vermi possono anche essere usati ripetutamente, rendendoli più economici. Quando stavamo sviluppando questa tecnica, volevamo irradiare solo una parte degli animali con un microbeam al microscopio. Quindi avevamo bisogno di chip chiari e molto sottili in grado di contenere gli animali.
Per iniziare, posizionare un foglio sottile e trasparente sul palco per utilizzarlo come pellicola di copertina inferiore. Posizionare delicatamente un foglio di verme sulla pellicola di copertura inferiore con pinzette piatte. Posizionare almeno tre goccioline di soluzione tampone sulla superficie di una piastra di Petri non trattata di 6 centimetri.
Quindi, scegli diversi C.elegans adulti con un raccoglitore platina da un piatto di cultura. Trasferire gli animali su una goccia con il raccoglitore platina e consentire agli animali di nuotare nel tampone per rimuovere eventuali batteri. Lavare gli animali in due goccioline separate e sciacquare gli animali in un'altra goccia.
Quindi, posizionare una goccia di soluzione tampone sulla superficie del foglio del verme. Rimuovere gli animali lavati dalla goccia tampone e trasferirli in una goccia sul foglio del verme. Utilizzare una pinzetta piatta per posizionare una pellicola di copertura PS sopra il foglio del verme e premere delicatamente sui canali da un'estremità all'altra del foglio.
O semplicemente far cadere gli animali in goccioline e sigillare delicatamente con la pellicola di copertura in modo che la goccia si diffonda tra la copertura e i fogli di verme con gli animali all'interno del canale. Confermare che gli animali sono vivi controllando il movimento con un microscopio a ingrandimento 1-2x. Registrare le posizioni degli animali e notare in particolare il numero del canale in cui ogni animale è racchiuso e la posizione di ciascun animale nel canale.
Per raccogliere animali immobilizzanti, utilizzare una pinzetta piatta per rimuovere la pellicola di copertura dal foglio del verme, quindi far cadere 10-15 microlitri di soluzione tampone su uno dei canali microfluidici che racchiudono gli animali. Sotto lo stereomicroscopio, osserva gli animali mentre iniziano a girare. Quindi usa il raccoglitore platina per raccogliere gli animali da nuoto e trasferirli su un piatto di dosaggio.
Dopo aver racchiudeto gli animali come precedentemente dimostrato, osservare macchie fluorescenti sugli animali con un microscopio a farinescenza. Quindi immagine della propagazione dell'onda ionica di calcio utilizzando l'acquisizione video per osservare le attività dinamiche. Posizionare il foglio di verme usato su una piastra di petri di sei centimetri e posizionare circa 100 microlitri di acqua ultra pura sterilizzata sul foglio.
Utilizzare le dita guantate per stendere l'acqua sulla superficie del foglio e lavare via eventuali contaminanti. Quindi, utilizzare salviette monouso per rimuovere l'umidità dal foglio del verme. Erogare cinque millilitri di 70% di etanolo nella piastra di Petri e utilizzare le dita guantate per stendere l'etanolo sul foglio del verme.
Infine, dopo che il foglio è asciutto, posizionare il foglio su una piastra di Petri sterile e coprire. Utilizzando questo protocollo, è stata studiata l'idoneità di diversi film di copertina. Non c'era alcuna differenza significativa nella motilità tra animali di controllo e animali racchiusi in canali microfluidici con pellicola PS.
Al contrario, la motilità è stata significativamente ridotta negli animali racchiusi sotto un vetro di copertura. Anche la motilità degli animali racchiusi con un film per animali domestici è stata significativamente diminuita. È importante selezionare attentamente le pellicole di copertura per la sigillatura dei canali microfluidici.
Utilizzando questo protocollo, abbiamo valutato l'idoneità di diversi film di copertina attraverso test di locomozione degli animali tre ore dopo l'immobilizzazione su chip. Utilizzando questa tecnica, intendevamo sviluppare un chip bagnabile ultrasottile solo per l'irradiazione dei microbi. Tuttavia, questi fogli worm sono già stati utilizzati per l'imaging e i saggi comportamentali oltre le loro applicazioni originali.
