La coltura del callo delle piante fornisce una soluzione per la valutazione accurata, efficiente e rapida della degradazione metabolica degli xenobiotici nelle piante. La coltura del callo delle piante può escludere l'interferenza del microbioma o dei funghi e la degradazione fotochimica, semplificare l'effetto matrice delle piante intatte, standardizzare le condizioni di coltivazione, ridurre la durata del trattamento e richiedere meno sforzo sperimentale. Il metodo qui proposto potrebbe fornire informazioni sul comportamento di assorbimento e sui meccanismi metabolici di diversi inquinanti organici sulle colture ed è utile per gli sforzi sulla valutazione del rischio ambientale.
Per iniziare, sterilizzare in autoclave tutta l'attrezzatura ed eseguire tutte le operazioni in un banco da lavoro ultra pulito sterilizzato ai raggi UV. Sterilizzare la superficie del seme vernalizzata con etanolo al 75% per 20 minuti. Sciacquarli tre volte con acqua deionizzata sterile e sterilizzarli nuovamente con perossido di idrogeno al 20% per 20 minuti.
Dopo aver lavato i semi con acqua deionizzata sterilizzata per sei volte, farli germinare in modo asettico seminando su terreno Murashige e Skoog autoclavato, privo di ormoni, a pH 5,8 contenente gel di agar all'1% e incubare a 26 gradi Celsius con un fotoperiodo di 16 ore per 15 giorni. Dopo 15 giorni di incubazione del seme, tagliare l'ipocotile e il cotiledone della piantina in piccoli pezzi di 0,5 centimetri per ottenere gli espianti. Trasformare gli espianti in una capsula di Petri contenente da 15 a 20 millilitri di terreno Murashige e Skoog autoclavato, integrato con Oxymon e Ficocianina e incubare al buio a 26 gradi Celsius per tre o quattro settimane per indurre il callo.
Utilizzando un bisturi sterile e una pinza, separare il callo di circa un centimetro di diametro formato dagli espianti iniziali. Per il trattamento, sciogliere 2, 4-dibromofenolo in 10 millilitri di liquido asettico Murashige e Skoog medium. Quindi aggiungere tre grammi di callo di carota separato alla soluzione preparata di 2, 4-dibromofenolo.
Dopo aver preparato il terreno in bianco come descritto nel manoscritto, incubare tutti i palloni al buio. Per preparare il campione, separare accuratamente il callo dai palloni di trattamento con 2, 3-dibromofenolo e controllo mediante filtrazione con filtri in fibra di vetro da 0,45 micron. Lavare il callo tre volte con acqua ultrapura prima di raccoglierlo.
Liofilizzare tutti i calli raccolti e omogeneizzare 0,2 grammi di callo essiccato con un macinatore di tessuti ad alta produttività a 70 hertz per tre minuti. Utilizzare una microsiringa di vetro per aggiungere 50 microlitri di 4-n-nanofenolo deuterato surrogato nel callo omogeneizzato e nel vortice per un minuto. Aggiungere cinque millilitri della soluzione contenente un rapporto uguale di metanolo e acqua al callo a spillo e sonicarlo per 30 minuti per estrarre il 2, 4-dibromofenolo e i metaboliti.
Dopo l'estrazione, centrifugare la sospensione a 8.000 G a quattro gradi Celsius per 10 minuti e raccogliere il surnatante mediante pipettaggio. Passare l'estratto attraverso l'estrazione idrofila lipofila bilanciata in fase solida o la cartuccia HLB-SPE con una portata di un millilitro al minuto. Diluire gli analiti facendo passare sei millilitri di metanolo attraverso la cartuccia HLB-SPE.
Quindi concentrare l'eluente ottenuto a un millilitro sotto un leggero flusso di azoto gassoso per l'analisi strumentale. Per l'analisi, aprire lo sportello del riscaldatore a colonna. Quindi installare la colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni collegando l'ingresso della colonna alla valvola di iniezione e l'uscita all'ingresso dello spettrometro di massa.
Inserire l'estremità dei tubi del solvente A e B nei corrispondenti flaconi del solvente. Posizionare le fiale dei campioni in base al numero di serie nelle posizioni corrispondenti dei vassoi dei campioni e reinserire i vassoi dei campioni nella camera del campione. Nella finestra del software, fare clic su Strumento, quindi su Metodo di ingresso per modificare le condizioni per il cromatogramma liquido.
Selezionare MS Method e impostare i parametri dell'analisi dello spettro di massa. Fare clic su File e quindi su Nuovo per creare e assegnare un nome al database. Caricare il programma di esempio creato in precedenza selezionando MS File, seguito da Inlet File e Inject Volume.
Salvare il database nella cartella di esempio del progetto facendo clic su File e su Salva. Quindi, seleziona Esegui e avvia nella finestra principale del software e fai clic su Acquisisci dati di esempio, seguito dal pulsante OK nell'elenco di avvio dell'esecuzione dell'elenco di campioni per raccogliere i dati. Per elaborare i dati, selezionare la riga dei dati di destinazione e fare clic sulla finestra del cromatogramma per visualizzare il cromatogramma MS Scan.
Nella finestra del cromatogramma, fare clic su Display, seguito da TIC. Dopo aver fatto clic sull'onda di scansione DS, aggiungere trace e OK per ottenere la scansione degli spettri di massa figlia. Il cromatogramma dell'estratto di callo di carota trattato con 2, 4-dibromofenoli ha mostrato la presenza di otto diversi metaboliti rispetto ai campioni di controllo.
Inoltre, l'assenza del picco del genitore 2, 4-dibromofenolo dal cromatogramma indica il rapido metabolismo del 2, 4-dibromofenolo nel callo della carota in condizioni sperimentali. Inoltre, il 2,4-dibromofenolo incubato nel callo di carota ha portato alla formazione di metaboliti per coniugazione diretta con glucosio e aminoacidi. Tutte le apparecchiature, così come i terreni Murashige e Skoog, devono essere sterilizzati in autoclave per garantire che la differenziazione e la manutenzione del callo della pianta vengano eseguite in condizioni asettiche.
Gli approcci omici che seguono questa procedura consentono di creare un chiaro quadro meccanicistico fitotossico degli inquinanti ambientali.
