Gli autori desiderano ringraziare la funzione avanzata microscopia ottica (www.aomf.ca) presso la University Health Network per l&#39;assistenza con la microscopia, e Mr. Jason Ellis dalla principessa Margaret Cancer Center Machine Shop per la fabbricazione del WC e la fase di imaging. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Iris Kulbatski per l&#39;editing manoscritto.

NOTA: Tutto il lavoro animale è stato realizzato sotto il protocollo # 2615 approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa University Health Network. 1. Preparazione chirurgica del mouse <ol><li> Prima dell&#39;intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e la camera di finestra (WC) in autoclave. Supplemento l&#39;acqua potabile con 50 mg / kg di peso corporeo di amoxicillina 2 giorni prima dell&#39;intervento. Iniettare il mouse con 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per via intraperitoneale 4 ore prima dell&#39;intervento. </li><li> Anestetizzare il mouse nudo atimici mediante iniezione intraperitoneale di soluzione salina 350-400 ml contenente 80 mg / kg di ketamina e 13 mg / kg xylazina (Nota: Questo è stato approvato dal comitato di assistenza istituzionale degli animali, e non abbiamo avuto alcuna esperienza con effetti negativi ). Verificare il corretto anestesia testando per riflessologia plantare. Continuare l&#39;osservazione per il modello di respirazione, il colore delle mucose e di riflesso del piede durante la procedura. </li><li> Eseguire la pr chirurgicaocedures sotto un armadio biosicurezza per mantenere condizioni di sterilità durante l&#39;intervento chirurgico. Posizionare il mouse su un rilievo di riscaldamento elettrico coperto con un telo chirurgico per mantenere la temperatura corporea durante l&#39;intervento chirurgico. Eseguire tutte le procedure chirurgiche con lo stereomicroscopio. </li><li> Applicare una pomata oculare per mantenere gli occhi umidi durante l&#39;intervento chirurgico. Ripetere se necessario durante la procedura chirurgica. Sterilizzare l&#39;area di funzionamento del mouse strofinando con 7,5% iodopovidone, il 70% di alcol isopropilico e 10% iodopovidone consecutivamente, e ripetere la procedura due volte. </li><li> Fare un 10 millimetri incisione cutanea longitudinale mediante bisturi con una lama (# 15), si avvicina il femore dalla parte laterale. Esporre il femore tra i muscoli flessori ed estensori per via smussa con pinze e pinze emostatiche per garantire la funzionalità muscolare. </li><li> Inserire la barra a forma di U sotto l&#39;osso, e installare il WC (Figura 1). Fissare la barra con la finestra con due dadi, e serrare i dadi perfunghi porcini. Riempire lo spazio tra l&#39;osso e il WC con cemento dentale. </li><li> Rettificare l&#39;osso corticale in una regione 6 x 2 mm 2 con un micro-trapano per ottenere l&#39;accesso ottico alla cavità midollare. Nota: Ispezionare attentamente assottigliamento della corticale ossea sotto il microscopio durante l&#39;esecuzione di questa procedura. Lasciare intatto, quasi trasparente strato periostale dell&#39;osso. </li><li> Posizionare il coprioggetti 8 millimetri sulla finestra, e fissare il coprioggetti con un anello elastico per tenerlo in posizione. </li><li> Regolare la muscolatura dei flessori ed estensori della schiena nelle loro posizioni originali, utilizzando una pinza per mantenere la loro funzione dopo l&#39;intervento chirurgico. Suturare il derma utilizzando 5-0 di sutura e un porta aghi. </li><li> Monitorare il mouse per il recupero, finché è cosciente ed è in grado di muoversi liberamente. Mettere l&#39;animale in una nuova gabbia quando recuperati. </li><li> Dopo il recupero, eseguire l&#39;acquisizione di immagini sull&#39;animale lo stesso giorno o nei giorni successivi (vedere la sezione 2). Monitorare il Physicondizioni cal del mouse quotidiana. Nota: monitorare le condizioni fisiche, come ad esempio sostenere il peso sull&#39;arto, incurvando, respirazione rapida e superficiale, posteriori gonfiore degli arti, automutilazione, cellulite e dermatite grave. </li><li> Dare iniezione intraperitoneale di 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per 3 giorni, e 1 mg / kg di peso corporeo di meloxicam per 5 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico per il trattamento del dolore post-operatorio e l&#39;infiammazione. Continuare a fornire l&#39;acqua amoxicillina-integrato per 5 giorni. </li><li> Al endpoint sperimentale, eutanasia dell&#39;animale da CO 2 narcosi seguita da un metodo secondario (ad esempio, dislocazione cervicale). </li></ol> 2. Acquisizione Immagine Usando combinata multi-fotone e Microscopia confocale <ol><li> Prima di imaging, anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione salina 350-400 microlitri contenente 80 mg / kg ketamina e 13 mg / kg xylazina. In alternativa, utilizzare anestetico inalabile, quando disponibile.Applicare una pomata oculare. </li><li> Iniettare la miscela di coloranti intravascolari per l&#39;etichettatura vascolare (0,65 mg di 2 MDa fluoresceina (FITC) -dextran) e neutrofili (4 mg di Allophycocyanine (APC) anticorpo -Anti-Ly6G). </li><li> Utilizzare un montante combinato multi-photon e microscopio confocale equipaggiato con un laser multi-photon vanno da 705-980 nm per eccitazione a due fotoni, così come i laser di fotoni singoli che fornisce lunghezze d&#39;onda di eccitazione dal blu al rosso. </li><li> Impostare una fase di imaging su misura sul microscopio (Figura 1B). Fissare il mouse sul palco da serraggio le due estremità del WC con morsetti a coccodrillo. Nota: i componenti critici della fase sono: due morsetti a coccodrillo per tenere il WC, ed un elemento di riscaldamento per mantenere la temperatura fisiologica (37 ° C) del mouse durante l&#39;imaging. </li><li> Accendere il laser a due fotoni e il sistema confocale, e avviare il software di acquisizione delle immagini cliccando su &quot;Avvio del sistema&quot;. Una finestra con 4 schede (Locate,Acquisizione, elaborazione, e mantenere) si aprirà. </li><li> Impostare i canali di imaging. Fai clic su &quot;Smart Setup&quot; nella scheda di acquisizione e scegliere le tinte che saranno utilizzati per l&#39;imaging: FITC (488 nm di eccitazione, 493-588 nm di emissione) e APC (633 nm di eccitazione e di emissione 638-743 nm). Scegliere &quot;miglior segnale&quot; e fare clic su &quot;Applica&quot;. </li><li> Aggiungere la seconda immagine canale di acquisizione generazione armonica (SHG) manualmente. Accendere il laser a due fotoni sotto la finestra &quot;laser&quot; nella scheda di acquisizione. Sotto la finestra Canali, fare clic sul segno &quot;+&quot; per aggiungere una traccia. </li><li> Impostare la pista SHG. Modificare la lunghezza d&#39;onda di 840 nm sotto la finestra Canali utilizzando le frecce su e giù, e scegliere l&#39;intervallo di rilevamento di essere 415-425 nm sotto la finestra &quot;Percorso Light&quot; utilizzando la barra di scorrimento. </li><li> Clicca su &quot;Oculari online&quot; nella scheda Locate. Fare clic FITC sotto l&#39;impostazione del filtro per FITC per visualizzare la regione di interesse e regolare la messa a fuoco manualmente girando tsi concentrano manopola sul lato del microscopio. Quando si trova la regione di interesse, cliccare su &quot;Oculari Offline&quot; nella scheda Locate. </li><li> Fare clic sulla scheda di acquisizione. Selezionare FITC pista sotto la finestra dei canali e cliccare su &quot;Live&quot; per visualizzare in anteprima l&#39;immagine di FITC-destrano con l&#39;obiettivo 5X. Regolare la messa a fuoco, se necessario, e fare clic su &quot;Stop&quot; nella scheda di acquisizione per interrompere l&#39;anteprima. </li><li> girare manualmente a 20X obiettivo acqua spostando una ruota sopra le lenti. Visualizza l&#39;immagine ancora per FITC-destrano con l&#39;obiettivo 20X e regolare Maestro Gain e Pinhole sotto la finestra canali per ottenere ottimale del segnale e il contrasto. Ripetere l&#39;operazione per gli altri canali selezionando APC e SHG tracce sotto la finestra Canali. </li><li> Scegli i parametri di imaging. Clicca su &quot;Modalità di acquisizione&quot; per aprire la finestra. Impostare la dimensione del frame per essere 1.024 x 1.024 pixel, e una media di 4X per ottenere immagini di alta qualità. </li><li> Acquisire una fotografia 2D. Selezionare tutti i canali sotto Canali vincereDow e clicca su &quot;Snap&quot; nella scheda di acquisizione. Controllare la qualità dell&#39;immagine e modificare i parametri di imaging se necessario. </li><li> immagini time-lapse 2D acquisire. <ol><li> Controllare off &quot;Time Series&quot; nella scheda di acquisizione per aprire la finestra Time Series. Digitare 0 sotto gli intervalli, e 40 per il numero totale di scansioni a prendere 40 immagini in modo continuo, senza intervallo di tempo. Nota: 40 scansioni genera circa 5 minuti lungo tempo serie con una velocità di scansione di 7,5 sec / telaio e le dimensioni dell&#39;immagine di 600 micron x 600 micron. Regolare l&#39;intervallo e il numero di scansioni seconda microscopio, impostazioni di acquisizione dell&#39;immagine e il frame rate della telecamera. Un intervallo di tempo fisso (&gt; 0 sec) può essere utilizzata per confrontare le immagini time-lapse acquisite in diversi momenti. Una durata time-lapse imaging più lungo può essere necessario in base alla velocità media attesa dei neutrofili (o altre cellule di interesse) nella condizione sperimentale. </li></ol></li><li> Acquisire immagini 3D.<ol><li> Controllare off &quot;Z-Stack&quot; nella scheda di acquisizione per aprire la finestra Z-Stack. Avviare il &quot;Live&quot; modalità di anteprima per FITC-destrano. Focus sulla parte superiore del campione e clicca &quot;Set First&quot;, e concentrarsi sull&#39;altra estremità del campione e clicca &quot;Set Ultimo&quot; nella finestra Z-stack. </li><li> Impostare l&#39;intervallo per essere di 10 micron sotto la finestra Z-stack. A seconda della prima e l&#39;ultima fetta ottica selezionato nel passaggio precedente, questo genererà 10-20 fette, con spessore ottico complessivo di 90-180 micron. Nota: L&#39;intervallo di z-stack dipende dalla dimensione del foro di spillo, che determina lo spessore della fetta ottica. Impostare l&#39;intervallo di essere inferiore allo spessore della fetta ottica. </li><li> Fare clic su &quot;Start Experiment&quot; nella scheda di acquisizione per iniziare a raccogliere le immagini. </li></ol></li><li> immagini time-lapse in 3D acquisire. <ol><li> Controllare off &quot;Time Series&quot; e &quot;Z-stack&quot; nella scheda di acquisizione per aprire la serie storicae le finestre Z-stack. </li><li> Impostare le serie storiche e parametri di acquisizione Z-stack come descritto ai punti 2.14 e 2.15. Fare clic su &quot;Start Experiment&quot; nella scheda di acquisizione per iniziare a raccogliere le immagini. </li></ol></li><li> Monitorare il mouse durante l&#39;imaging per assicurarsi che sia stabile e privo di sensi. Se il mouse è instabile e / o cosciente durante l&#39;imaging, rimuovere il mouse dal palco, iniettare ulteriore 100-150 ml di soluzione di anestetico per via intraperitoneale, e continuare l&#39;imaging. Nota: segni di instabilità includono respirazione veloce e il movimento del mouse, che può essere visto come spostamento artefatti in immagini acquisite. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione delle immagini, prendere il mouse fuori dal palco e restituirlo alla gabbia. Utilizzare una lampada riscaldante per mantenerlo caldo, e controllare il mouse fino a quando non è cosciente. </li></ol> 3. Immagine analisi e quantificazione <ol><li> Utilizzare immagine software di analisi per analizzare i dati 3D e di serie temporali. Aprire il software eaggiungere immagini trascinandole nella schermata aperta, che si chiama vista &quot;Arena&quot;. Fare doppio clic su un file di immagine per aprirlo; l&#39;immagine verrà aperta in vista &quot;Surpass&quot;. </li><li> Creare un&#39;immagine 2D / 3D. <ol><li> Dalla barra &quot;Altro&quot; che si trova nell&#39;angolo in alto a destra, fare clic su &quot;Modifica / Mostra regolazione Display&quot; per aprire la finestra &quot;Regolazione Display&quot;. Ottimizzare la visualizzazione di fluorescenza regolando le soglie per ogni canale, e scattare un&#39;istantanea per salvare l&#39;immagine. </li></ol></li><li> Generare tracce degli oggetti utilizzando immagini time-lapse. <ol><li> Aprire l&#39;immagine da analizzare in vista &quot;Surpass&quot;. Fare clic sull&#39;icona con l&#39;immagine di puntini arancioni, che si trova sotto l&#39;icona &quot;Surpass&quot;. Si aprirà una nuova finestra &quot;Spot&quot;. </li><li> Controllare off &quot;Spot Track (nel tempo)&quot; e fare clic sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Selezionare il canale che contiene gli oggetti da tracciare sotto &quot;Channel Source&quot;, e impostare il diamet oggetto stimatoer under &quot;Diametro XY stimato&quot; digitando un numero. Clicca sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Nota: per il monitoraggio dei neutrofili, selezionare il canale che contiene APC fluorescenza per neutrofili e impostare il diametro dell&#39;oggetto da 12 micron in base alle dimensioni noto di neutrofili. </li><li> Nella finestra, trovare e selezionare il filtro &quot;Qualità&quot; facendo clic sulla freccia verso il basso. Osservare i punti definiti dal software e regolare manualmente la soglia per includere o escludere macchie. Una volta che la soglia è definita, cliccare sulla freccia blu per andare al passo &quot;Tracking&quot;. </li><li> Secondo l&#39;algoritmo, trovare e selezionare &quot;Motion Algoritmo Autoregressive&quot; cliccando sulla freccia verso il basso. Digitare 10 micron per &quot;Max Distance&quot; e 3 per &quot;Max Gap Size&quot; trovato sotto Parametri. Controllare off &quot;Riempire lacune con tutti gli oggetti rilevati&quot; per iniziare a monitorare, e fare clic sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Nota: &quot;algoritmo di movimento Autoregressive&quot; è utilizzato fo oggetti che hanno diretto il movimento, dal momento che genera le tracce in base alla posizione prevista dal movimento precedente. &quot;Max Distance&quot; e &quot;Max Gap Size&quot; può essere regolata a seconda della dimensione prevista e velocità dell&#39;oggetto essere monitorati, nonché la durata complessiva dell&#39;immagine time-lapse. </li><li> In Tipo di filtro, selezionare il filtro &quot;Durata&quot;. Fare clic sulla freccia verde per completare il monitoraggio, e controllare le tracce che sono stati generati. Torna al passaggio precedente, se necessario, per ordinare manualmente le tracce. </li></ol></li><li> Se le derive di immagini time-lapse generati, corretti per la deriva traslazionale. <ol><li> Fare clic sull&#39;icona con l&#39;immagine di una matita. Si tratta di una scheda di editing che si apre &quot;Modifica Tracce&quot; finestra. Esaminare l&#39;immagine time-lapse e trovare un posto di riferimento che non dovrebbe essere in movimento per tutte le immagini. </li><li> Nell&#39;angolo in alto a sinistra dello schermo, trovare finestra &quot;Pointer&quot; e spuntare &quot;Select&quot; per attivare la cursor per la selezione di un posto. Fare clic sul posto di riferimento. </li><li> Fai clic su &quot;Drift corretta&quot; nella finestra &quot;Modifica Tracce&quot;. Controllare off &quot;traslazionale Drift&quot;. Il software genera automaticamente la serie corretta di immagini. </li></ol></li><li> Misurare il movimento cellulare definito dalle tracce degli oggetti nelle immagini time-lapse. <ol><li> Sotto la finestra &quot;Edit Tracks&quot;, spuntare &quot;Tracce&quot; e selezionare una traccia che rappresenta il movimento di una cellula. La traccia selezionata verrà evidenziata in giallo l&#39;immagine di serie temporali in. </li><li> Fare clic sull&#39;icona con l&#39;immagine di un grafico per aprire la finestra (scheda Statistiche) &quot;Statistiche&quot;. </li><li> Sotto &quot;Selezione&quot;, selezionare &quot;Track Media&quot; facendo clic sulla freccia verso il basso per generare la velocità pista significa per la traccia selezionata. Scegli diverse tracce e ripetere la procedura per misurare la velocità pista significa per tutte le cellule di interesse. </li></ol></li></ol>

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J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), (2013).</li><li>Koewler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Monoclonal+Antibody+Raised+Against+Nerve+Growth+Factor+on+Skeletal+Pain+and+Bone+Healing+After+Fracture+of+the+C57BL/6J+Mouse+Femur.">Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur.</a> J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system.">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genetics.">Mouse Genetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

In tempo reale, imaging seriale dei processi cellulari dinamici nel midollo osseo fornisce informazioni che altrimenti difficile da ottenere con tecniche convenzionali quali l&#39;istologia e emocromo totale. Il modello di WC femore qui descritto fornisce opportunità uniche per indagare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo nel corso del tempo. Sebbene un modello femore WC è stato riportato in precedenza, il design innovativo fornisce un più grande campo di ripresa di vista e piccole dimensioni com...

Il midollo osseo è un importante organo coinvolto nella emopoiesi e regolazione immunitaria. Si compone di un componente ematopoietiche contenente cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs), e una componente stromale che contiene cellule progenitrici ematopoietiche non che danno origine a cellule mesenchimali 1. Due terzi di attività ematopoietiche è dedicato alla generazione di cellule mieloidi 2. In particolare, un gran numero di neutrofili sono prodotte nel midollo osseo, con 1-2 x 10 11 cellule generate al giorno in un normale umano adulto 2. I neutrofili sono la prima linea di difesa contro le infezioni microbiche e sono per lo più riservati nel midollo osseo fino lo stress innesca la loro mobilitazione per integrare i neutrofili periferici 1,3. Oltre ai loro effetti anti-microbici, studi recenti suggeriscono un ruolo importante dei neutrofili in biologia del cancro, avendo entrambi pro e fenotipi anti-cancerogeni a seconda della crescita trasformandofattore beta (TGF-β) di segnalazione nel 4,5 microambiente tumorale. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che i neutrofili che si accumulano nei tumori primari esercitano effetti pro-cancerogeni e metastatici sopprimendo la funzione citotossica delle cellule T 6,7, mentre i neutrofili in circolazione esercitano un citotossico, effetto anti-metastatico 8. Come tale, ricerca di cellule ematopoietiche del midollo osseo, in particolare neutrofili, è fondamentale per chiarire il loro ruolo nella regolazione immunitaria e tumore. Istopatologia e un conteggio completo del sangue periferico sono abitualmente utilizzati per valutare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo 9. Tuttavia, questi metodi forniscono solo informazioni statiche di diverse popolazioni cellulari o tissutali microstrutture. Longitudinale imaging in vivo può essere utilizzato in combinazione con i metodi standard per valutare le dinamiche di molteplici componenti cellulari, vascolari e stromali e cellula-cinterazioni ell in modo longitudinale. Microscopia intravitale (IVM), definito come l&#39;imaging di animali vivi con risoluzione microscopica 10, è particolarmente utile per valutare i processi cellulari dinamici nel tempo nello stesso campione, riducendo il numero di animali sperimentali richiesto. IVM è spesso combinato con una camera di finestra cronicamente trapiantato (WC) per accedere al organo di interesse per l&#39;imaging su una durata di settimane o mesi. modelli WC cranici e dorsale-plica hanno la più lunga storia di utilizzo che risale alla metà degli anni 1990. Più recentemente, altri modelli WC organo-specifiche, quali quelle del pad grasso mammario e vari organi addominali sono stati sviluppati 11. L&#39;approccio tipico per l&#39;imaging del midollo osseo in vivo ha l&#39;esposizione occupa principalmente della calvaria di topi, dove l&#39;osso assottigliata permette la visualizzazione diretta di singole cellule con un intervento chirurgico minimo 12-14. Tuttavia, il midollo osseo cranica May Be distinto da quello di altre ossa, come l&#39;osso lungo, come dimostrato da un numero inferiore di HSPCs e cellule ipossiche in calvaria, che indica ridotta manutenzione e lo sviluppo HSPCs 15. Pertanto, approcci alternativi per la valutazione componenti cellulari nel lungo osso sono stati indagati. Questi includono l&#39;esposizione diretta del midollo osseo femorale 16 e il trapianto ectopica di femore scissione dorsale plica WC 17. Tuttavia, il primo è un procedimento terminale che non consente il monitoraggio delle alterazioni cellulari, strutturali e funzionali su periodi di tempo più lunghi, e il secondo probabilmente disturba la normale funzione del midollo osseo a causa del trapianto di femore, a un sito ectopica all&#39;interno del WC dorsali plica. Un altro metodo che permette l&#39;imaging seriale ortotopico di midollo osseo femorale nel tempo è l&#39;uso di un WC nell&#39;osso femorale. Un rapporto precedente ha dimostrato l&#39;imaging a lungo termine della microcircolazione nel midollo osseo femorale utilizzando unafemore WC nei topi 18. Inoltre, gli autori hanno dimostrato visualizzazione delle cellule tumorali nel femore, indicando la sua utilità nel monitoraggio midollo osseo metastasi. Tuttavia, questo motivo WC era limitata dalla sua grande dimensione (1,2 cm di diametro) e relativamente piccola area di esposizione (4 mm di diametro), che era adatto solo per grandi topi (26-34 g, 3-6 mesi di età) rendendo così la approccio pratico per l&#39;uso di routine. Pertanto, un nuovo bagno con un ingombro più piccolo e più grande area di esposizione interna creata per lo scopo di questo studio. L&#39;obiettivo di questo studio era quello di fornire un metodo per l&#39;imaging vari tipi di cellule nel midollo osseo femorale. Il modello di WC femore è stato sviluppato in-house ed è stato utilizzato per visualizzare e monitorare neutrofili all&#39;interno della rete vascolare 3D. Utilizzando questo modello, IVM del midollo osseo può essere eseguito serialmente oltre 40 giorni. Questo approccio può essere applicato ad una varietà di campi per chiarire i processi di ematopoiesi, regolazione immunitaria unlo sviluppo del tumore ND.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NRCNU-F athymic nude mice</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>Ncr nude</td>
			<td>8-10 weeks old, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1302P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&#160;</td>
			<td>DIN 01989529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td>
			<td>DIN 02169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Proxima</td>
			<td>DYNJP2405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Life Brand</td>
			<td>57800827375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (tear gel)</td>
			<td>Novartis&#160;</td>
			<td>T296/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>GreenField</td>
			<td>P010IP7P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-150-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle (#3)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (#15)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors curved</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-Mixter Hemostat</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill</td>
			<td>Harvard Apparaus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill burrs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femur window chamber</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped bar</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (8mm)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>HBIO 64-0701 CS-8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring (8mm)</td>
			<td>ACKLANDS GRAINGER</td>
			<td>UNSPSC # 31163202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts (hexagon stainless steel)</td>
			<td>Fastenal</td>
			<td>70701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>3M</td>
			<td>RelyX U200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 Monosof black)</td>
			<td>Covioien</td>
			<td>SN-5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12501-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>DIN 0281251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>DIN 02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin (Clamavox)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02027879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 710 NLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging stage</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris 8.0</td>
			<td>Image analysis software described in Section 3 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Murine midollo osseo femorale si accede con successo utilizzando il WC per consentire la visualizzazione individuale neutrofili e reti vascolari. La Figura 1 mostra lo strumento WC e descrive la procedura chirurgica, che comporta l&#39;esposizione dell&#39;osso femorale e assottigliamento dell&#39;osso corticale per ottenere l&#39;accesso ottico all&#39;interno ossea. La chirurgia è ben tollerato nei topi; sono stati valutati per reazioni fisiche avverse, come gonfiore ...

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Femore finestra del modello Camera per<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

8.1K Views.  Princess Margaret Cancer Centre. The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Video: Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Femore finestra del modello Camera per

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