L'obiettivo generale di questa procedura di infusione del dotto pancreatico è quello di consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare nel pancreas. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave sulle malattie che colpiscono il pancreas, tra cui pancreatite cronica, diabete e cancro al pancreas. Per iniziare, posiziona un topo anestetizzato sotto un microscopio sezionante in modo che il suo addome sia posizionato al centro del campo visivo.
Immobilizzare l'animale con un nastro chirurgico e quindi applicare un unguento oftalmico ai suoi occhi per evitare che si secchino. Quindi, coprire l'addome del mouse con uno spesso strato di crema per la depilazione. E dopo circa tre minuti, pulire delicatamente la crema con una garza imbevuta di etanolo al 70% per rimuovere tutti i capelli.
Infine, pulire la pelle con etanolo al 70%, seguita da una soluzione di ioduro di povidone al 10% per rimuovere eventuali contaminanti e disinfettare la pelle. Per iniziare l'intervento chirurgico, creare con un bisturi un'incisione cutanea della linea mediana che si estende dal processo xifoide all'ombelico. Quindi, usando la pinza Adson, sollevare il peritoneo e fare con le forbici un piccolo foro della linea mediana.
Espandere il taglio lungo la linea mediana del peritoneo in modo che la sua lunghezza sia uguale alla lunghezza dell'incisione cutanea. Quindi, utilizzare divaricatori smussati per tirare su il fegato e dopo aver esposto il dotto biliare comune, bloccarlo con un morsetto vascolare bulldog curvo. Identificare il duodeno e con la pinna Arruga, estrarlo caudalmente per visualizzare la papilla visibile come una macchia bianca sulla superficie anteriore della seconda porzione del duodeno.
Per identificare il dotto pancreatico, prelevare il duodeno caudalmente, quindi posizionare un ago di calibro 30-1/5 tangenzialmente al duodeno e fare una puntura sulla sua parete che si trova direttamente di fronte alla papilla. Per infondere la soluzione, introdurre il catetere collegato a una pompa di infusione attraverso la duodenotomia creata e farlo scorrere lungo il condotto fino a quando non è visibile all'interno del vaso, ma raggiunge non più di un centimetro per evitare di bypassare affluenti duttali minori. Immobilizzare il catetere bloccandolo con un secondo morsetto vascolare bulldog curvo.
Quindi accendere la pompa per avviare l'infusione di 150 microlitri della soluzione nel condotto. Quindi, iniettare al peritoneo del topo circa 1,5 millilitri di soluzione salina per evitare qualsiasi perdita di volume infuso e quindi coprire l'intestino esposto con una garza inumidita per prevenire l'essiccazione. Una volta completata l'infusione, rilasciare il catetere immobilizzato e utilizzando il morsetto bulldog, rimuoverlo delicatamente dal dotto pancreatico.
Quindi rilasciare il morsetto dal dotto biliare comune. Chiudere il peritoneo e la pelle suturandoli continuamente in un unico strato e somministrare la prima delle due dosi di analgesico, la seconda delle quali verrà somministrata il giorno successivo. Quindi riportare il topo in una gabbia posizionata sotto una lampada di calore e fornire all'animale cibo e acqua ad libitum.
Osservare il topo fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente manifestata in reclinenza sternale. Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, l'accisa dal pancreas animale eutanasizzato e dalla milza, dal fegato e dal duodeno che fungono da controlli. Immergere tutti i tessuti isolati in una soluzione di paraformaldeide al 4% e fissarli a quattro gradi Celsius durante la notte.
Una volta fissati i tessuti, crio proteggere i campioni immergendoli in una soluzione di saccarosio al 30% a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo una protezione criomio durante la notte, congelare i campioni in azoto liquido e, utilizzando un microtomo, tagliare le sezioni di tessuto a sei micrometri. Infine, immagina le sezioni al microscopio fluorescente.
Qui sono presentate immagini microscopiche di sezioni di pancreas asportati da topi sette giorni dopo un intervento chirurgico fittizio e l'infusione del dotto pancreatico di AAV8 che trasporta il gene GFP. Il fegato, la milza e il duodeno isolati dal topo infuso con AAV8 non hanno mostrato alcun segnale GFP mentre il pancreas ha rivelato un'espressione GFP prominente, confermando la consegna specifica del pancreas del virus dopo infusione del dotto pancreatico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti se eseguita correttamente.
Durante l'esecuzione di questa procedura, è molto importante eseguire un'attenta dissezione e realizzare la più piccola duodenotomia possibile per l'introduzione del catetere. Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha spianato la strada ai ricercatori che studiano il pancreas per indagare su una serie di patologie che affliggono l'organo, tra cui pancreatite cronica, diabete e cancro al pancreas sia nei roditori che nei modelli animali più grandi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come infondere in modo efficace e selettivo il dotto pancreatico.
