Questo lavoro è stato sostenuto dal premio AHA No. 15BGIA23250030, l&#39;Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali della NIH sotto il numero di premio 8P20 GM103432-12 e dall&#39;Università del Wyoming Facoltà Grant in Aid to BT.

Tutti i protocolli seguono le linee guida per l&#39;animale dell&#39;Università del Wyoming. 1. Alloggiamento e alimentazione alimentare NOTA: I topi selvatici maschi adulti (C57BL / 6) (età da 12 a 24 settimane) sono stati allevati nella struttura degli animali di ricerca secondo i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali (IACUC). <ol><li> A partire dalla settimana 6 di età, i topi casa in gruppi di quattro in gabbie separate e assegnarli in modo casuale in gruppi di alimentazione di NCD o HFD (± 0,01% CAP) fino alla 38a settimana di età. NOTA: CAP è un agonista della proteina del canale TRPV1 espresso nei tessuti adiposi 11 , 17 . Mescolare CAP con HFD in un frullatore all&#39;interno della cappa e trasferire la miscela miscelata su un vassoio contenente piccole partizioni da 1 a 2 . Tenere il vassoio all&#39;interno di un congelatore -20 ° C. Rimuovere il vassoio contenente la dieta HFD + CAP dal congelatore dopo 24 ore e conservare in un contenitore a -20 &amp;# 176; C congelatore fino all&#39;uso. </li><li> I topi domestici in un ambiente controllato dal clima (22,8 ± 2,0 ° C, umidità del 45-50%) con ciclo 12/12-luce / scuro con accesso alla dieta e all&#39;acqua ad libitum . </li><li> Alla fine di 38 settimane, si disseccano tessuti adiposi inguinali e si usano per esperimenti di lipolisi (sezioni 2-7). </li></ol> 2. Preparare i topi per gli esperimenti <ol><li> Anestetizzare i topi iniettando la miscela ketamina e xilazina (rispettivamente 10 mg / kg e 80 mg / kg di peso corporeo). Iniettare 0,01 ml della miscela / 10 g di peso corporeo del mouse. </li><li> Confermare l&#39;anestesia profonda da un pizzico di punta duro. Se c&#39;è un riflesso a pedale, prova nuovamente il mouse dopo almeno 30 s. </li><li> Utilizzare unguento veterinario per prevenire la secchezza degli occhi durante l&#39;anestesia. Non lasciare i topi non controllati durante nessuna delle procedure. </li><li> Eutanizzare i topi iniettando una dose elevata di iniezione di miscela di ketamina e xilazina (rispettivamente 10 mg / kg e 80 mg / kg di peso corporeo)E (0,01 ml / 10 g di peso corporeo) seguito da dislocazione cervicale. NOTA: Questo metodo di eutanasia è approvato dall&#39;IACUC dell&#39;Università del Wyoming. </li></ol> 3. Isolamento dei rilievi grassi adiposi inguinali <ol><li> Posizionare il mouse (alimentato con NCD o HFD (± CAP) per 32 settimane) che si trova sulla sua sinistra per la procedura. NOTA: posizionando il mouse sul lato sinistro, la parte anteriore sinistra e l&#39;indietro posteriore sinistra saranno sulla piattaforma di dissezione, mentre il destro e il dorso posteriore destro si affaccieranno dalla piattaforma. </li><li> Sterilizzare la superficie della pelle con un 2 pollici pad 2 garza imbevuta in circa 2,5 ml di etanolo al 70%. Fare un taglio laterale da 2 a 3 mm attraverso la pelle usando un bisturi per rivelare lo strato grasso sottostante. </li><li> Fai un taglio di 1 cm (a seconda della dimensione del mouse) attraverso la pelle usando un bisturi appena sotto la gabbia della cavità attraverso la superficie dorsale che unisce le due incisioni laterali. </li><li> Sbucciate il fodero della pelle trascinandolo con attenzioneUtilizzando pinze sterili e lasciare intatte il tampone sottocutaneo non tagliando i pastiglie grassi. Questo è il tampone di grasso che si trova sotto la pelle. </li><li> Disseccare attentamente il tampone di grasso dal muscolo sottostante e dalla fascia usando un paio di forbici. Tirare il tampone di grasso come è tagliato dal muscolo sottostante. NOTA: Il peso e la dimensione dei pastiglie grassi dipendono dal tipo di topi (NCD o HFD (± CAP)). </li><li> Usate le pinzette per trasferirlo a un piatto di Petri contenente fosfato tamponato salina (PBS) fino all&#39;esperienza di lipolisi, a temperatura ambiente (~ 15 min). </li><li> Isolare i pattini di grasso dal lato destro del mouse come descritto nei passaggi 3.2-3.6. </li></ol> 4. Liberazione di glicerolo basale dai rilievi di grasso inguinale <ol><li> Usare forbici affilate per tagliare circa 20 mg di tessuto grasso in 5 a 8 pezzi. </li><li> Incubare i pezzi tagliati di pastiglie grasso inguinale in 200 μl di mezzo di incubazione (DMM) di Dulbecco&#39;s Modified Eagel Medium (DMEM) contenente 2% di acido grassoAlbumina bovina serba libera (BSA)) a 37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità per 60 min. <ol><li> Raccogliere il mezzo di incubazione e congelare a -80 ° C per il dosaggio della lipolisi. NOTA: i pezzi tagliati vengono utilizzati per la determinazione della concentrazione proteica dopo l&#39;estrazione lipidica. </li><li> Trasferire i pezzi di grasso tagliato con l&#39;aiuto di pinzette in 1 ml di soluzione di estrazione (cloroformio: metanolo (2: 1, v / v) e acido acetico glaciale 1%) e incubare per 60 minuti a 37 ° C sotto vigorosa agitazione a 100 rpm. Scartare la soluzione di estrazione del grasso. NOTA: questa fase estrae grassi dai pezzi tagliati. Scartare la soluzione di estrazione del grasso in quanto interferirà con la determinazione della proteina. </li><li> Trasferire il tessuto (dal punto 4.2.2) utilizzando le pinzette in un tubo microfugo sterile contenente 500 μL di soluzione di lisi (0,3 N NaOH contenente 0,1% di sodio dodecil solfato SDS) e incubare per una notte (12 h) a 55 ° C sotto vigorosa scossa A 100 giri / min. </li></ol></li><li> Determinare la concentrazione proteica del tessuto (punto 4.2.3) utilizzando il reagente acido bicinconico (BCA) e BSA come standard 18 . </li><li> Scongelare il mezzo congelato (punto 4.2.1) sul ghiaccio e determinare il contenuto di glicerolo del mezzo utilizzando un reagente libero di glicole come descritto nelle sezioni del protocollo 6 e 7 6 . <ol><li> Estrapolare la concentrazione di glicerolo in campioni dalla curva standard tracciata utilizzando standard di glicerolo 19 e lipolisi espressa come nanomoli glicerolo per mg proteina per h 20 . </li></ol></li></ol> 5. Lipolisi stimolata da FSK <ol><li> Preincubare circa 20 mg di rilievo grasso inguinale (da 5 a 8 pezzi tagliati) ottenuto da un topo selvatico tipo NCD o HFD (± CAP) in 200 μL DMEM contenente 2% BSA libero di grasso, 10 μM FSK e 5 μM Triacsin C 37 ° C in 5% CO 2 e 95% di umidità per 60 min. </strong&gt; <ol><li> Trasferire i pezzi di tessuto utilizzando le pinzette ad un medesimo medesimo e incubare per altri 60 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità. Raccogliere il mezzo di incubazione e conservare a -80 ° C fino al dosaggio della lipolisi. NOTA: La stimolazione della lipolisi provoca un rapido rilascio di acidi grassi e glicerolo entro 15 minuti, che è lineare durante la prima ora, e successivamente gli altipiani. Poiché il tasso di lipolisi stimolato è maggiore e stabile tra la prima e la seconda ora della stimolazione FSK, questo protocollo ha misurato la lipolisi nello stato stimolato successivo al secondo periodo di incubazione come descritto in precedenza 1 . Così, entrambi i passaggi sperimentali (5.1 e 5.1.1) sono necessari. </li></ol></li><li> Per estrarre i grassi dai tamponi grassi inguinali, trasferire i pezzi tagliati di pastiglie grasso inguinale (ottenuto da topi NCD o HFD (± CAP)) dalla fase 5.1 con l&#39;aiuto di pinzette in 1 mL di soluzione di estrazione (cloroformio: metanolo (2 : 1. v /V) e 1% di acido acetico glaciale) e incubare per 60 minuti a 37 ° C sotto agitazione energica a 100 giri / min. Scartare il grasso estratto. </li><li> Trasferire il tessuto (dalla fase 5.2) utilizzando le pinzette in un tubo microfugo sterile contenente 500 μl di soluzione di lisi (0.3 N NaOH contenente 0.1% SDS) e incubare per una notte (12 h) a 55 ° C sotto scosse energiche a 100 giri / min. </li><li> Determinare la concentrazione proteica e il contenuto di glicerolo del tessuto come descritto nei passaggi 4.3 e 4.4 rispettivamente. </li></ol> 6. Preparazione del Reagente Glicerolo Libero <ol><li> Ricostituire il reagente del glicerolo 19 in 40 ml di acqua deionizzata in una fiala di vetro color ambra, mettere un tappo sulla fiala e mescolare bene invertendo 10 volte. Non mescolare agitando. </li><li> Conservare il flaconcino a 4 ° C all&#39;interno di un frigorifero protetto dalla luce coprendo completamente la fiala con la lamina di alluminio. </li><li> Procedere alla preparazione del glicerolo standard (sezione 7). </li&gt; </ol> 7. Preparazione del Glicerolo Standard e Determinazione del Contenuto di Glicerolo <ol><li> Fare uno stoccaggio di 1 mM diluendo 35 μL del materiale fornito con 65 μL di acqua deionizzata. NOTA: Il produttore fornito di grezzo standard è 2,8 mM di glicerolo. </li><li> Prendere cinque lunghezze di 1 cm di lunghezza monouso delle cuvette metacrilato. Etichettare le cuvette utilizzando un marcatore come standard 0, 1,25, 2,5, 5 e 10 nmol. </li><li> Aggiungere 0, 1,25, 2,5, 5 e 10 μL di 1 mM glicerolo standard alle rispettive cuvette etichettate. Compilare il volume di ogni cuvetta a 10 μL con acqua deionizzata. </li><li> Fai da 1 a 10 diluizione di tutti i campioni (dal punto 4.4 o 5.1.1) aggiungendo 10 μL del campione a 90 μL di acqua deionizzata in nuovi tubi di centrifuga prelevati da 500 μl. Aggiungere 10 μL di campioni diluiti nelle cuvette contrassegnate con il rispettivo numero di identificazione del campione. </li><li> Accendere lo spettrofotometro UV-VIS e impostare l&#39;ondaLunghezza a 540 nm. </li><li> Riscaldare il reagente libero di glicerolo a temperatura ambiente mantenendo la fiala (fase 6.2) a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Impostare una serie di cuvettes etichettate come standard blank &quot;0&quot; nmol (passo 7.3), standard (passo 7.3) e campioni (passo 7.4). </li><li> Aggiungere 10 μL di ciascuno degli standard e del campione nella rispettiva cuvetta etichettata. Usare &quot;0&quot; standard nmol come vuoto. </li><li> Aggiungere 0,8 ml di reagente glicerolo libero in ogni cuvetta, contenente gli standard di glicerolo usando una pipetta da 1 ml. </li><li> Coprire la cuvetta con una pellicola di paraffina di plastica quadrata da 1,5 cm e mescolare il contenuto invertendo la cuvetta per 3 volte e mettere da parte a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro UV-VIS e registrare l&#39;assorbanza (lunghezza d&#39;onda 540 nm). </li><li> Tracciare la curva standard utilizzando le concentrazioni degli standard (nmol) nell&#39;asse X e l&#39;assorbanza registrata nell&#39;asse Y. </li><li> Calcolare la concentrazione di glYcerol nei campioni (nmol) mediante estrapolazione utilizzando la curva standard tracciata nel passaggio 7.12. </li><li> Moltiplicare la concentrazione di campioni (nmol / cuvetta) con il fattore di diluizione 10 (vedere la fase 7.4) e 20 (volume totale) </li><li> Dividere la concentrazione di glicerolo in ogni campione (passo 7.13) con la mg di proteina calcolata dal metodo BCA. NOTA: dal momento che i campioni di grasso inguinale sono incubati per 60 min, rappresentano i risultati come nmol di glicerolo / mg proteine ​​/ h. </li></ol>

<ol><li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li>
<li>Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+adipose+tissue%3A+an+endocrine+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ.</a> Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).</li>
<li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+biology+and+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).</li>
<li>Barquissau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White-to-brite+conversion+in+human+adipocytes+promotes+metabolic+reprogramming+towards+fatty+acid+anabolic+and+catabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways.</a> Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).</li>
<li>Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+adipocyte%3A+a+model+for+integration+of+cytokine+signaling+in+the+regulation+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).</li>
<li>Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown+and+pink+adipocytes%3A+the+extraordinary+plasticity+of+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ.</a> Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).</li>
<li>Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+lipolysis+as+a+metabolic+pathway+to+define+pharmacological+strategies+against+obesity+and+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome.</a> Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).</li>
<li>Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+fat%3A+the+role+of+adipose+triglyceride+lipase+in+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis.</a> Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).</li>
<li>Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+triglyceride+lipase+regulates+basal+lipolysis+and+lipid+droplet+size+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes.</a> J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).</li>
<li>Kolditz, C. I., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue lipolysis.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).</li>
<li>Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsaicin+induces+browning+of+white+adipose+tissue+and+counters+obesity+by+activating+TRPV1+channel-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRPV1+by+dietary+capsaicin+improves+endothelium-dependent+vasorelaxation+and+prevents+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension.</a> Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+lipolysis+response+to+adipose+afferent+reflex+involved+in+impaired+activation+of+adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone+sensitive+lipase+pathway+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity.</a> Sci Rep. 6, 34374(2016).</li>
<li>Ohyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+exercise+and+capsinoid+supplementation+additively+suppresses+diet-induced+obesity+by+increasing+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).</li>
<li>Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+steady+state+and+nonsteady-state+glycerol+kinetics+in+humans+using+deuterium-labeled+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer.</a> J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).</li>
<li>Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric+method+for+measuring+glycerol+levels+and+enrichments+in+plasma+using+13C+and+2H+stable+isotopic+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers.</a> Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).</li>
<li>Baskaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+activation+counters+diet-induced+obesity+through+sirtuin-1+activation+and+PRDM-16+deacetylation+in+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue.</a> Int J Obes (Lond). , (2017).</li>
<li>Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+upregulation+of+CD24+in+pre-adipocytes+promotes+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis.</a> Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).</li>
<li>Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf">http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf</a> (2017).</li>
<li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li>
<li>Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipolysis+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipolysis in adipocytes.</a> Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).</li>
<li>Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skinny+on+fat%3A+lipolysis+and+fatty+acid+utilization+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes.</a> Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).</li>
<li>Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+triglyceride+metabolism.+IV.+Hormonal+regulation+of+lipolysis+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).</li>
<li>Jeppesen, J., Kiens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+limitations+to+fatty+acid+oxidation+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise.</a> J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).</li>
<li>Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+energy+metabolism+by+long-chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids.</a> Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).</li>
<li>Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+free+fatty+acids+and+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+in+the+control+of+myocardial+uncoupling+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels.</a> Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).</li>
<li>Barbera, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+activates+transcription+of+the+brown+fat+uncoupling+protein-1+gene.+A+link+between+regulation+of+the+thermogenic+and+lipid+oxidation+pathways+in+the+brown+fat+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell.</a> J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).</li>
<li>Leung, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsaicin+as+an+anti-obesity+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Drug+Res%22%5BJournal%5D)">Capsaicin as an anti-obesity drug.</a> Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).</li>
<li>Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermogenic+ingredients+and+body+weight+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Thermogenic ingredients and body weight regulation.</a> Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).</li>
<li>Kang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+capsaicin+reduces+obesity-induced+insulin+resistance+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice+fed+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).</li>
<li>Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+glycerol+uptake+to+plasma+glycerol+concentration+in+the+normal+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog.</a> Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).</li>
<li>Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+microfluidic+enzyme+assays+for+simultaneous+detection+of+lipolysis+products+from+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes.</a> Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il processo di rottura di TGL in glicerolo e acidi grassi è catalizzato da ATGL 9 durante la lipolisi basale e orchestrato da una serie di proteine, tra cui l&#39;attivazione del percorso adenilil ciclasi / PKA dipendente durante la lipolisi stimolata 21 , 22 , 23 . L&#39;aumento della lipolisi aumenta i livelli plasmatici degli acidi grassi per il trasporto e l&#39;utilizzo di energia <sup class="xref"...

I tessuti adiposi conservano l&#39;energia in quanto il grasso 2 e l&#39;ossidazione dell&#39;acido grasso sono necessari per la termogenesi 3 , 4 . Gli acidi grassi ingeriti attraverso le diete sono confezionati insieme ad apoproteine ​​in chimomicroni e consegnati a diversi tessuti nel corpo attraverso la circolazione del sangue. Anche se la maggior parte delle cellule del corpo conserva una riserva di energia, il tessuto adiposo conserva l&#39;energia in eccesso come grasso 5 , 6 . La lipolisi nel tessuto adiposo è regolata da processi complessi ei dettagli molecolari della lipolisi rimangono ancora vaghi 7 . La lipolisi è un processo attraverso il quale i trigliceridi (TGL) immagazzinati nel tessuto adiposo vengono idrolizzati per produrre glicerolo e acidi grassi (FA) dall&#39;enzima liposica adiposa triglicerida (ATGL) 8 . Le alterazioni nella lipolisi basale e stimolata sono una caratteristica dell&#39;obesità. Il bLa lipolisi asale è regolata dall&#39;attivazione ATGL 9 , che converte TGL in diacylglycerol (DAG), che viene successivamente idrolizzato in monoacil glicerolo (MAG). L&#39;attivazione della lipasi sensibile all&#39;ormone (HSL) tramite l&#39; adenilil ciclasi attiva la stimolazione della proteina kinasi A (PKA) dipendente dalla adenosina monofosfata (cAMP) e provoca la lipolisi. La misurazione della lipolisi, basale e stimolata, è quindi importante per analizzare l&#39;attività delle proteine ​​coinvolte in questo processo. Inoltre, distruggere la regolazione molecolare della lipolisi può essere utile per sviluppare nuove strategie terapeutiche contro l&#39;obesità 10 . Poiché le molecole che stimolano la lipolisi e l&#39;ossidazione dell&#39;acido grasso sono potenziali candidati per la riduzione dei grassi conservati nei depositi, è importante impiegare un saggio robusto per la riproducibilità. I dati precedentemente pubblicati suggeriscono che l&#39;attivazione della proteina TRPV1 espressa in tessuto adiposo bianco per CAP basale miglioratoE FSK (attivazione di adenilil ciclasi) - lipolisi stimolata nei pad grassi inguinali 11 . Precedenti ricerche suggeriscono anche che l&#39;attivazione a lungo termine di TRPV1 da parte della PAC attiva PKA 12 . Dal momento che l&#39;attivazione della PKA stimola la lipolisi 13 , 14 , misurando sia la lipolisi stimolata basale sia PKA-dipendente in placche grasso inguinale isolate da topi NCD o HFD (± CAP) dopo 32 settimane di alimentazione delle rispettive diete convalideranno il ruolo di TRPV1 Attivazione nella lipolisi. Questo articolo descrive un metodo efficiente per determinare la lipolisi basale e stimolata. Sebbene siano disponibili altri metodi che impiegano isotopi radioattivi di glicerolo e cemente cromatografica a massa ad alta prestazione o gas cromatografia / spettrometria di massa per le misurazioni 15 , 16 , questo metodo offre un metodo più diretto, semplice e convenienteTecnica per determinare la lipolisi nei tessuti adiposi.

<table><tbody><tr><td>Capsaicin</td><td>Sigma, USA</td><td>M2028</td><td>TRPV1 agonist</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma, USA</td><td>F6886</td><td>Adenylyl cyclase activator</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE healthcare and life sciences, UT, USA</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>High fat diet</td><td>Research diets, New Brunswick, USA</td><td>D12492</td><td>Abbreviated as HFD</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, USA</td><td>O497</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma, USA</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, USA</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma, USA</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma, USA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol reagent</td><td>Sigma USA</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma, USA</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Triacsin C</td><td>Sigma, USA</td><td>T4540</td><td>Acyl CoA transferase inhibitor</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma, USA</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermofisher Scientific, USA</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Amresco, USA</td><td>O583</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma, USA</td><td>L3371</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid reagent</td><td>Sigma, USA</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrophotometer</td><td>Pharmacia Biotech, NJ, USA</td><td>Ultrospec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Normal chow diet</td><td>Labdiet.com</td><td>500I</td><td>abreviated as NCD</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratory, CT, USA</td><td>Stock number000664</td><td>wild type mice</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Heathrow Scientific, USA</td><td>HS 234526A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol standard</td><td>Sigma, USA</td><td>G7793</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads

La lipolisi è un processo attraverso il quale il lipide immagazzinato come trigliceridi nei tessuti adiposi viene idrolizzato in glicerolo e acidi grassi. In questo articolo viene descritto il metodo per la misura della lipolisi stimolata da basale e forskolin (FSK) nei placchetti grassi inguinali isolati da topi selvatici alimentati sia alla dieta normale di chow (NCD), alla dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) o ad una dieta ad alto contenuto di grassi contenente 0,01 % Di capsaicina (PAC, agonista subfamiglia 1 del vincolo di vanilloide transitorio transitorio (TRPV1)) per 32 settimane. Il metodo descritto qui per l&#39;esecuzione della lipolisi ex vivo è adottato da Schweiger et al. 1 Presentiamo un protocollo dettagliato per misurare i livelli di glicerolo mediante spettrofotometria UV-Visibile (UV / VIS). Il metodo qui descritto può essere utilizzato per isolare con successo i rilievi grassi inguinali per le misurazioni della lipolisi per ottenere risultati coerenti. Il protocollo descritto per i pasticci grassi inguinali può essere facilmente esteso per misurare la lipolisi in altri tessuti.

Per valutare l&#39;effetto della CAP sulla lipolisi basale e stimolata, questa ricerca ha misurato la lipolisi nei pad grassi adiposi inguinali isolati da topi selvatici NCD o HFD (± CAP). I risultati rappresentativi per la lipolisi basale e FSK stimolata per i pastori grassi inguinali sono riportati nella Tabella I. Basal e FSK-rilascio glicerolo in presenza di Triacsin C, che inibisce la sintetasi acil coA e impedisce la rigenerazione di TGL. Come mostrato nella <stro...

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Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Questo protocollo descrive il metodo di determinazione della lipolisi basale e forskolin-stimolata nei pastelli grassi inguinali ottenuti dalla normale dieta di chow (NCD) o dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) ± capsaicina alimentata da topi selvatici. Come indice per la lipolisi, il rilascio di glicerolo è stato misurato dai placche grasse adipose inguinali.

Misurazione della lipolisi stimolata da Basal e Forskolin nei ghiandoli grassi adiposi inguinali

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

measurement-basal-forskolin-stimulated-lipolysis-inguinal-adipose-fat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.6K Views.  University of Wyoming.  Questo protocollo descrive il metodo di determinazione della lipolisi basale e forskolin-stimolata nei pastelli grassi inguinali ottenuti dalla normale dieta di chow (NCD) o dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) ± capsaicina alimentata da topi selvatici. Come indice per la lipolisi, il rilascio di glicerolo è stato misurato dai placche grasse adipose inguinali. 

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Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l&#39;apoptosi omeostasi

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health. Still, there are significant limitations to available primary culture models, all of which have failed to faithfully recapitulate the adipose microenvironment or extend WAT viability beyond two weeks. The lack of a reliable primary culture model severely impedes research in WAT metabolism and drug development. To this end we have utilized NIH's standards of a microphysiologic system to develop a novel platform for WAT primary culture called 'SWAT' (sandwiched white adipose tissue). We overcome the natural buoyancy of adipocytes by sandwiching minced WAT clusters between sheets of adipose-derived stromal cells. In this construct, WAT samples are viable over eight weeks in culture. SWAT maintains the intact ECM, cell-to-cell contacts, and physical pressures of in vivo WAT conditions; additionally, SWAT maintains a robust transcriptional profile, sensitivity to exogenous chemical signaling, and whole tissue function. SWAT represents a simple, reproducible, and effective method of primary adipose culture. Potentially, it is a broadly applicable platform for research in WAT physiology, pathophysiology, metabolism, and pharmaceutical development.

White adipose tissue (WAT) has critical deficiencies in its current primary culture models, hindering pharmacological development and metabolic studies. Here, we present a protocol to produce an adipose microphysiological system by sandwiching WAT between sheets of stromal cells. This construct provides a stable and adaptable platform for primary WAT culture.

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Comportamento

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Localizzazione, identificazione, e l&#39;escissione dei Depositi Murine adipose

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Medicina

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Immunologia e infezioni

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Biologia

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

Valutazione della capacità di manipolazione dei lipidi di tutto il corpo nei topi

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with multiple lipid droplets, a central nucleus, a high mitochondrial content, and the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). BAT has been proposed as a potential therapeutic target for obesity and its associated metabolic disorders due to its ability to dissipate metabolic energy as heat. To investigate BAT function and regulation, brown adipocyte culturing is indispensable. The present protocol optimizes tissue processing and cell differentiation for culturing brown adipocytes from newborn mice. Additionally, procedures for the imaging of differentiated adipocytes with both confocal immunofluorescence and transmission electron microscopy are shown. In the brown adipocytes differentiated with the techniques described herein, the major defining features of classical BAT are preserved, including high UCP1 levels, increased mitochondrial mass, and very close physical contact between the lipid droplets and mitochondria, making this method a valuable tool for BAT studies.

Preadipocytes are isolated from the stromal vascular fraction of interscapular brown adipose tissue from newborn mice and differentiated into cells that accumulate lipid droplets, express molecular markers, and show the mitochondrial morphology of mature brown adipocytes. These cells are further analyzed by immunofluorescence and transmission electron microscopy.

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are sequentially cleaved from the glycerol backbone, resulting in the release of free fatty acids and glycerol. Due to the low expression of glycerol kinase in white adipocytes, glycerol re-uptake rates are negligible, while fatty acid re-uptake is dictated by the fatty acid binding capacity of media components such as albumin. Both glycerol and fatty acid release into media can be quantified by colorimetric assays to determine the lipolytic rate. By measuring these factors at multiple time points, one can determine the linear rate of lipolysis with high confidence. Here, we provide a detailed protocol for the measurement of lipolysis in in vitro differentiated adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice. This protocol may also be optimized for other preadipocyte cell lines or adipose tissue from other organisms; considerations and optimization parameters are discussed. This protocol is designed to be useful in determining and comparing the rate of adipocyte lipolysis between mouse models and treatments.

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceride lipolysis in adipocytes is an important metabolic process resulting in the liberation of free fatty acids and glycerol. Here, we provide a detailed protocol to measure basal and stimulated lipolysis in adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice.

Misurazione del tasso di lipolisi nel tessuto adiposo murino ex vivo e nei preadipociti primari differenziati in vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Isolamento semi-automatico del tessuto adiposo bianco murino

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autore in primo piano: Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino utilizzando un dissociatore tissutale  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Misurazione della lipolisi stimolata da Basal e Forskolin nei ghiandoli grassi adiposi inguinali

Riepilogo

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Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l'apoptosi omeostasi

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Localizzazione, identificazione, e l'escissione dei Depositi Murine adipose

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

Valutazione della capacità di manipolazione dei lipidi di tutto il corpo nei topi

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

Misurazione del tasso di lipolisi nel tessuto adiposo murino ex vivo e nei preadipociti primari differenziati in vitro

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale