L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la desensibilizzazione e il recupero della sensibilità dei fotorecettori di gamberi in funzione del tempo circadiano, utilizzando registrazioni elettriche intercellulari di cellule fotorecettore in stock oculari isolati, impiegando la configurazione discontinua del morsetto di tensione commutato a singolo elettrodo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come la dipendenza del tempo circadiano di così tante proprietà elettrofisifiche dei fotorecettori in inattivazione e recupero. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione dell'attività elettrica dei fotorecettori.
Nonostante la difficoltà di isolare le cellule e senza disturbare l'ambiente intracellulare. A dimostrare questa procedura saranno i dottori Carolina Barriga-Montoya e Araceli de la O-Maritnez, colleghi del nostro laboratorio. Per preparare l'elettrodo intracellulare, tirare il tubo capillare in vetro con un estrattore di micropipette per ottenere una punta sottile con una piccola apertura.
Quindi, riempire il vetro capillare tirato con soluzione di cloruro di potassio 2,7 molare per capillarità e quindi riempire metà della pipetta con un ago di iniezione fine. Se necessario, toccare la pipetta dell'elettrodo per eliminare le bolle d'aria. Successivamente, posizionare l'elettrodo sul suo supporto.
Collegare il supporto allo stadio di testa dell'amplificatore con l'amplificatore. In seguito, posizionare lo stadio di testa del supporto dell'elettrodo con un micromanipolatore 3D stabile. Abbassare l'elettrodo fino a quando la soluzione del bagno copre la punta.
Selezionare la modalità ponte dell'amplificatore e misurare la resistenza dell'elettrodo. Assicurarsi che la resistenza sia di circa 50 megaohms. Annullare la corrente di offset e compensare i transitori capacitivi utilizzando il pulsante di posizione di tenuta nel morsetto di tensione di sezione dell'amplificatore e il pulsante di neutralizzazione della capacità nella sezione Microelectrode 1 dell'amplificatore.
Per costruire il sistema di super fusione, versare la soluzione da bagno in un recipiente adatto e collegarla a un set di tubi di irrigazione, collegando così la camera di registrazione. Utilizzare un sistema di superfusione a gravità. Regolare la portata a 0,5 millilitri al secondo.
Collegare la camera a un dispositivo di aspirazione. Regolare il sistema di aspirazione della soluzione con una pompa per vuoto in modo tale che il volume totale della camera di registrazione non vari. Per isolare lo stock oculare di un gambero adulto, staccarlo dalla base con un paio di forbici fini.
Fai un'apertura di un millimetro quadrato nella cornea dorsale usando una lama di rasoio per accedere alla retina. Quindi, posizionare il materiale oculare al centro della camera di registrazione con l'apertura alla retina rivolta verso l'alto. Tieni gli occhi nell'oscurità per 20 minuti.
Posizionare il microelettrodo parallelo all'asse longitudinale delle scorte oculari in modo tale che il microelettrodo sia centrato per accedere alla retina. Utilizzare un microscopio stereoscopico per posizionare i dispositivi nella configurazione corretta. Quindi, monitorare la differenza di tensione tra gli elettrodi di riferimento e di registrazione selezionando la modalità ponte dell'amplificatore.
Abbassare l'elettrodo nel bagno e posizionarlo proprio sopra la retina. Rimuovere il microscopio e posizionare la lampada fototimolante parallela all'asse longitudinale delle scorte oculari. Quindi, abbassare lentamente il microelettrodo fino a quando non viene rilevata un'improvvisa caduta di tensione.
Successivamente, fornire un flash di luce di prova per registrare il potenziale del recettore del fotorecettore. Per ottenere registrazioni appropriate di correnti provocate dalla luce, è fondamentale fare una buona compromissione di una cellula fotorecettori sana. In questa procedura, bloccare la tensione al potenziale misurato della membrana di riposo della cella selezionando l'ampiezza di tenuta nel software di acquisizione dati.
Quindi, selezionare la modalità DSEVC dell'amplificatore. Nella sezione mode dell'amplificatore, selezionare il tasto SEVC e passare alla discont. Posizione SEVC.
Impostare la velocità di commutazione su 500 a 1.000 hertz, come determinato dalla velocità dell'elettrodo. Successivamente, fornire un lampo di luce e osservare il flusso di ioni evocato. Quindi, fornire un paio di impulsi di luce e applicare il secondo flash dopo un intervallo di tempo desiderato.
Digitalizzare le correnti con un campionamento di 10 kilohertz con il software di acquisizione dati e salvare i dati per l'analisi offline. Qui è mostrato un protocollo a due impulsi. Gli stimoli leggeri sono stati applicati a zero millisecondi e 700 millisecondi.
Questa figura mostra il ripristino dalla desensibilizzazione. Ecco il recupero della latenza, ecco il picco di recupero corrente, ed ecco il tempo di desensibilizzazione costante tau recovery. Gli esperimenti sono stati eseguiti a zero ore circadiane.
Questa figura mostra il recupero dalla desensibilizzazione in funzione del tempo circadiano. Questo è il recupero iP, questo è il recupero L, e questo è il recupero tau, e questo grafico mostra le costanti di tempo ponderate. I processi bifasici sono contrassegnati da una freccia.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mirare a un basso rumore e una bassa corrente di perdita, compromissione del fotorecettore. Seguendo questa procedura, altri metodi, come i saggi farmacologici, possono essere fatti per rispondere a domande aggiuntive, come il coinvolgimento di particolari canali, recettori o vie di segnalazione.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare la dipendenza circadiana dal tempo delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule fotorecettori. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la desensibilizzazione e il recupero della corrente di trasduzione attivata dalla luce utilizzando la tecnica di registrazione intracellulare.
