Questo metodo potrebbe controllare gli RNA guida negli embrioni, testare le prime domande sullo sviluppo o creare topi modificati. Qualsiasi progresso in CRISPR Cas9 potrebbe essere utilizzato con questo metodo. Il vantaggio principale di questo metodo è che è facile da imparare e utilizza reagenti disponibili per i laboratori che hanno accesso ai topi.
In futuro, questa tecnica sarebbe utile per correggere una malattia o una mutazione nella prole di un animale da compagnia o di un animale importante per l'agricoltura. Questo metodo è più adatto per generare modelli di mouse. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato varianti di questo metodo per studiare gli eventi che circondano la fecondazione e lo sviluppo precoce del preimpianto, in particolare, la regolazione genica nella potenza dell'embrione.
La parte più impegnativa è usare l'ago di vetro per spostare gli embrioni da una piastra all'altra. A dimostrare questa procedura sarà Chantal Diallo, specialista di ricerca nel mio laboratorio. Per iniziare la raccolta e l'elaborazione degli embrioni, posizionare il topo femmina eutanasia sulla schiena e spruzzare il 70% di etanolo sull'addome da aprire chirurgicamente.
Per aprire la cavità addominale e rimuovere gli ovidotti, tagliare lo strato di pelle con le forbici chirurgiche e individuare le ovaie. Successivamente, rimuovere chirurgicamente entrambi gli ovidotti, situati prossimalmente alle ovaie, e posizionarli in singole goccioline da 50 microlitri di M2 più mezzo BSA. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una pinza da dissezione per incidere l'ampolla dell'ovidotto per rilasciare i complessi cumulo-ovocita, o COC, contenenti ovociti, quindi per evitare il trascinamento di detriti, trasferire e combinare ogni ovocita cumuliforme in una singola goccia da 50 microlitri di M2 più BSA con una pipetta maneggiata impostata su 20-30 microlitri.
Successivamente, per rimuovere le cellule del cumulo dagli zigoti, trasferire i COC con un po 'di media extra su una goccia di M2 da 100 microlitri più ialuronidasi e mescolare delicatamente mediante pipettaggio fino a quando gli embrioni sono visibilmente separati dalle cellule cumuliformi molto più piccole. Per diluire la ialuronidasi e rimuovere le cellule cumuliformi sciolte, utilizzare una pipetta azionata dalla bocca per spostare gli zigoti in una goccia fresca di M2 da 50 microlitri più BSA. Successivamente, per erodere la zona pellucida dell'embrione e ridurre ulteriori ostacoli fisici per la consegna del reagente, trasferire gli embrioni in una goccia preriscaldata da 100 microlitri di Tyrode acido, o soluzione AT, su una piastra da 60 millimetri.
Osservare continuamente gli zigoti al microscopio stereoscopico fino a quando il 30% della zona pellucida è eroso, quindi per diluire l'AT, passare gli embrioni attraverso quattro goccioline da 50 microlitri di M2 più BSA. Successivamente, determinare un numero appropriato di embrioni che sono stati elaborati contandoli al microscopio stereo. Diluire BSA facendo passare gli embrioni attraverso due goccioline da 50 microlitri di siero ridotto.
Successivamente, pipettare in bocca da 25 a 30 embrioni in una goccia da 10 microlitri di siero ridotto, quindi utilizzare una pipetta portatile per aggiungere 10 microlitri del complesso ribonucleoproteina o RNP. Diluire il glicerolo viscoso dal complesso RNP e omogeneizzare il campione pipettando 10 volte o fino a quando la miscela non mostra più viscosità. Successivamente, pipettare 20 microlitri di miscela di embrioni e RNP in una cuvetta di elettroporazione da 0,1 centimetri evitando le bolle, quindi per fornire i reagenti di editing nello zigote, elettroporare gli embrioni utilizzando un protocollo a onda quadra di 30 volt, da 4 a 6 impulsi con lunghezza di impulso di 3 millisecondi e intervalli di 100 impulsi.
Quindi, aggiungere 50 microlitri di M2 più BSA nella parte superiore della cuvetta per lavare gli embrioni dalla cuvetta e pipettare delicatamente questa miscela su una piastra. Per la coltivazione degli embrioni, trasferire da 20 a 30 zigoti in una goccia di KSOM più BSA in una piastra di coltura pre-equilibrata e spostare gli embrioni nella gocciolina. Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica con 95% di umidità.
Il giorno seguente, trasferire solo embrioni bicellulari in una goccia fresca di miscela KSOM più BSA e restituire la piastra all'incubatrice. Lasciare o scartare gli embrioni morti o non fecondati. Prima della genotipizzazione, lavare gli embrioni di blastocisti di morula con due gocce di DPBS per diluire i componenti del mezzo che potrebbero interferire con una reazione PCR.
Utilizzando una pipetta orale, trasferire i singoli embrioni in un pozzetto di una striscia PCR a 8 pozzetti e aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi. Successivamente, per lisare gli embrioni, programmare un termociclatore a 55 gradi Celsius per 4 ore, quindi inattivare la proteinasi K con un'incubazione di 10 minuti a 95 gradi Celsius. In questo studio, viene mostrata una strategia di esempio per indirizzare il locus tirosinasi del topo come controllo positivo, compresi i disegni oligo e le strategie di genotipizzazione per l'unione finale non omologa e la riparazione diretta dall'omologia.
Quando si fornisce una singola guida, o sgRNA, la consegna di RNP è stata fino al 100% incluso nei ceppi murini 6J neri e C57 6N neri C57 con formazione di delezioni di inserzione che si verificano al 50-100% e piccole sostituzioni a base di oligo che vanno dal 17 al 63%Quando si ingegnerizzano le delezioni genomiche, l'efficacia di editing varia dal 3% al 100%L'embrione deve essere mantenuto il più vicino possibile alle condizioni ideali, quindi più velocemente Il protocollo è fatto, meglio è. Inoltre, ridurre al minimo l'esposizione alla ialuronidasi e al tirodo acido. Questo metodo descrive la generazione di un animale modificato, testando l'impianto o la vitalità gestazionale, o eseguendo l'esperimento più volte per raccogliere misurazioni o immagini e varie metriche durante lo sviluppo pre-piantagione.
