Il nostro protocollo fornisce una pipeline sia per l'integrazione precisa che per il semplice rilevamento visivo delle modifiche CRISPR, nonché un esempio di fenotipizzazione post-edit. Il vantaggio principale di questo approccio è la facilità di rilevamento delle modifiche CRISPR, che consente un'identificazione efficiente e semplificata delle modifiche riuscite. Questo approccio consente una semplice generazione e caratterizzazione delle varianti associate alla malattia nel pesce zebra.
Qui, stiamo esaminando la sindrome del QT lungo. Gli studi di follow-up sulle terapie farmaceutiche sono quindi possibili da esplorare. Inizia progettando due guide sgRNA per asportare la sequenza del sito bersaglio knock-in identificando l'ortologo zebrafish per il gene di interesse.
Utilizzare Ensembl per individuare il sito target all'interno della sequenza genica di interesse, inclusa la sequenza di fiancheggiamento di due kilobasi utilizzata per creare il modello. Utilizzare uno strumento software di progettazione come CRISPOR e selezionare le specie di Danio rerio e l'enzima Cas. Per l'approccio a due sgRNA, scegliere uno sgRNA prima dell'esone bersaglio e un secondo sgRNA all'interno dell'introne immediatamente a valle.
Assicurarsi che gli sgRNA selezionati abbiano un'elevata specificità e un basso legame off-target previsto. Utilizza le classifiche CRISPOR per identificare le guide con un'associazione off-target minima. Ora identifica i potenziali siti off-target più probabili per la genotipizzazione del sequenziamento Sanger basata su PCR.
Dopo aver selezionato i due sgRNA, ottenere il complemento inverso per ciascuno, due oligo complementari che precedono la mutazione e due oligo complementari a valle della mutazione. Aggiungi siti di restrizione compatibili su ciascun oligo per incorporare la guida nel plasmide di scelta. Per l'integrazione delle sequenze guida selezionate nel plasmide DR274, creare una sporgenza utilizzando un sito di restrizione BSA1 a cinque primi e progettare i siti di riconoscimento BSA1 alle cinque estremità prime delle guide.
Successivamente, progettare il modello esogeno per l'HDR nel pesce zebra scegliendo due frammenti di sequenza che affiancheranno il gene reporter YFP venoso M ospitato nel plasmide PKHR5. Dividere il modello in due segmenti per inserirlo su entrambi i lati del gene reporter YFP venoso M. Assicurati che il sito diviso sia in un introne per evitare di tagliare la sequenza di codifica.
Incorporare tutte le modifiche richieste menzionate nel manoscritto per facilitare la clonazione nel plasmide PKHR5. Iniettare gli embrioni nella fase unicellulare a circa 40 minuti dopo la fecondazione. Dopo tre giorni di fecondazione, anestetizzare la larva di zebrafish trasferendola in una capsula di Petri da 25 millimetri contenente lo 0,3% di MS222 fino a quando non perdono il riflesso autoraddrizzante.
Una volta anestetizzata, trasferire la larva nel pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Utilizzando un microscopio in grado di rilevare GFP o YFP, eseguire lo screening per la fluorescenza genica reporter negli occhi della larva. Dopo aver catturato le immagini della larva, documentare la presenza o l'assenza dell'espressione genica del reporter.
Per confermare l'editing genetico HDR accurato e preciso, eseguire la genotipizzazione anestetizzando prima la larva tre giorni dopo la fecondazione come dimostrato in precedenza e isolando il DNA genomico dalla clip della coda utilizzando il metodo hotshot. Aggiungere la clip di coda asportata a 15 microlitri di idrossido di sodio 25 millimolare e incubarlo a 95 gradi Celsius per 20 minuti, quindi neutralizzare con 1,5 microlitri di acido cloridrico tris. Centrifugare a 13.800 volte G per 30 secondi e conservare il surnatante contenente il DNA genomico estratto.
Recuperare la larva nei media E3 e restituirla al sistema di alloggiamento se sono previsti ulteriori studi. Utilizzando il DNA genomico estratto come modello, eseguire il sequenziamento Sanger basato sulla PCR di siti on-target e potenziali off-target. Assicurarsi che il disegno del primer on-target catturi il sito di mutazione e il sito di legame dell'sgRNA più vicino.
Progettare un primer di sequenziamento separato per rilevare la transizione dal braccio di omologia inserito e dal gene bersaglio per confermare l'integrazione nel gene di interesse. Progetta primer per sequenziare i primi tre potenziali siti off-target. Compilare genotipizzazione on e off-target, frequenza cardiaca, dimensioni pericardiche, fenotipizzazione ECG e dati genetici reporter identificabili per ciascun pesce zebra.
L'espressione genica del reporter venoso YFP M è stata osservata nelle isole, agendo come un reporter positivo dell'integrazione del modello di successo. I pesci positivi al gene reporter sono risultati avere la modifica precisa G2A che introduce la variante R56Q in ZKCNH6A. Qui viene mostrata la misurazione delle dimensioni pericardiche come rapporto della zona degli occhi.
Una tendenza di bradicardia con aumento dell'edema pericardico associato ai disturbi della ripolarizzazione cardiaca nei pesci zebra è stata osservata nelle larve modificate dal gene R56Q. La registrazione ECG da un cuore di larva di zebrafish tre giorni dopo la fecondazione è mostrata qui. L'aspetto più importante di questo approccio è la progettazione delle guide, come spesso accade nelle procedure CRISPR.
Guide efficaci sono essenziali per modifiche CRISPR di successo. È possibile seguire metodi CRISPR alternativi che consentono una maggiore precisione o altre funzionalità. Inoltre, possono essere inseriti geni di grandi dimensioni come un complesso di editing primario che fornisce un sistema di editing inducibile in vivo.
