Gli strumenti di editing genomico basati su CRISPR hanno notevolmente facilitato la produzione di modelli rep geneticamente modificati. Il sistema CRISPR è composto da un singolo complesso di RNA guida a una nucleasi Cas9 e può essere programmato per mirare a una sequenza di interesse all'interno del genoma per creare una rottura del DNA a doppio filamento. Attraverso la co-consegna di un modello di riparazione del DNA, questa rottura del DNA può essere ripristinata con precisione insieme all'aggiunta di qualsiasi sequenza di DNA ingegnerizzata desiderata attraverso un processo chiamato Homology Directed Repair.
È attraverso questo processo che siamo in grado di generare modelli di ratto knock-in con inserzioni o sostituzioni di DNA mirate. Utilizzando questo protocollo, presentiamo un approccio modificato che utilizza un virus adeno-associato per fornire un modello di riparazione del DNA agli embrioni di ratto, insieme a una successiva somministrazione di complessi CRISPR Cas9 attraverso l'elettroporazione embrionale a due cellule. I sierotipi AAV 1 o 6 sono confezionati con un modello di riparazione del DNA ingegnerizzato progettato per essere integrato nel genoma del ratto attraverso il processo di riparazione diretta all'omologia mediato da CRISPR.
L'AAV viene aggiunto a una goccia di 30 microlitri di terreno KSOM di ratto a una concentrazione finale di 3 X 10 al 7° genoma copie per microlitro. Successivamente, gli embrioni allo stadio di una cellula appena raccolti con pronuclei visibili vengono quindi trasferiti nel terreno contenente AAV, consentendo la trasduzione virale. Utilizzando il nostro protocollo, non è necessario assottigliare la zona pellucida poiché i sierotipi AAV 1 e 6 sono in grado di passare prontamente attraverso per un'efficiente somministrazione del modello di riparazione del DNA.
Gli embrioni vengono coltivati con l'AAV per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e la massima umidità. Il giorno seguente, viene prodotta una miscela di elettroporazione contenente cento nanogrammi per microlitro di RNA guida singolo e cento nanogrammi per microlitro di proteina Cas9 diluita in terreni OptiMIM. La miscela viene incubata a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la formazione di complessi RNP CRISPR.
Durante il tempo di incubazione, l'elettroporatore viene acceso e gli elettrocateteri vengono attaccati agli elettrodi vetrini. Al termine della formazione dell'RNP, cinque microlitri di miscela per elettroporazione vengono pipettati tra gli elettrodi, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione. Gli embrioni, ora allo stadio di due cellule, vengono rimossi dal terreno contenente AAV e spostati con cautela nella miscela di elettroporazione tra gli elettrodi.
Gli embrioni sono allineati, assicurandosi che nessuno tocchi nessuno dei due elettrodi, in quanto ciò causerà la lisi durante l'elettroporazione. Ecco una vista di questa procedura attraverso il microscopio. È anche importante notare che l'impedenza diminuirà all'aumentare del volume tra gli elettrodi.
Per questo motivo, e per non diluire la miscela di elettroporazione, insieme agli embrioni deve essere trasferito una quantità minima di terreno. Successivamente, l'impedenza viene misurata premendo il pulsante con il simbolo di un ohm. L'impedenza deve essere compresa tra 0,18 e 0,3 ohm.
Se nel raggio d'azione, l'elettroporazione viene avviata premendo il pulsante di avvio. Questo processo richiede solo un paio di secondi, e questo è ciò che appare attraverso il microscopio. Noterai che si formano rapidamente bolle su ciascun elettrodo.
Subito dopo l'elettroporazione, gli embrioni vengono prelevati dal vetrino e lavati tre volte in terreni KSOM freschi per ratti. Gli embrioni possono quindi essere coltivati per studi in vitro o trasferiti a femmine surrogate per produrre prole viva. È importante notare che il gonfiore dell'embrione è comune dopo l'elettroporazione.
Questo gonfiore dovrebbe attenuarsi dopo alcune ore sulla coltura. È anche comune vedere eventi di fusione cellulare fino al 20% degli embrioni di due cellule dopo l'elettroporazione. La fusione cellulare può essere tipicamente evitata con un attento allineamento dell'asse orizzontale degli embrioni tra gli elettrodi.
Testare il nostro protocollo in embrioni di ratto e screening di blasti in coltura per l'inserimento di una breve sequenza di introni artificiali ingegnerizzati contenente due siti loxP. Abbiamo notato che oltre il 60% delle blastocisti contiene l'allele knock-in correttamente mirato sulla base dell'analisi della sequenza di nuova generazione. Successivamente, testando ulteriormente il nostro protocollo per produrre ratti knock-in vivi, progettiamo un progetto per ingegnerizzare una sequenza di rivestimento ricombinasico Cre mirata al sito di inizio ATG del gene DRD2 di ratto.
Degli 11 figli nati, 10 sono risultati positivi all'analisi PCR attraverso il braccio di omologia a cinque prime, tre a tre bracci di omologia primaria e un test PCR interno per rilevare la ricombinasi di Cre. In sintesi, su sette diversi progetti, abbiamo raggiunto un tasso medio di successo knock-in del 76% negli animali fondatori, come determinato dall'analisi PCR attraverso le giunzioni del braccio di omologia e dalla verifica della sequenza del DNA. Utilizzando questa trasmissione di DNA mediata da AAV e la pipeline di elettroporazione di embrioni a due cellule, abbiamo sperimentato efficienze knock-in significativamente più elevate rispetto agli approcci tradizionali per inserzioni di DNA fino a tre KB di lunghezza.
È anche importante notare che, mentre abbiamo dimostrato l'uso di questa procedura negli embrioni di ratto, può essere efficacemente applicata anche ad altre specie per generare inserzioni mirate di DNA.
