Esprimiamo la nostra gratitudine al gruppo del Dr. Eric Olson presso l'UT Southwestern Medical Center per aver generosamente condiviso i modelli animali. Apprezziamo tutti i commenti costruttivi forniti dai membri dell'incubatore D presso UT Dallas. Questo lavoro è stato supportato dal programma NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) e UT Dallas STARS (YD).

I protocolli e gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti sotto la supervisione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas a Dallas (IACUC # 21-03). In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL6, inclusi neonati al giorno 1 postnatale (P1) e adulti di 8 settimane. Non è stata osservata alcuna differenza tra maschi e femmine. Tutta l'acquisizione dei dati e la post-elaborazione delle immagini sono state effettuate utilizzando software o piattaforme open source con licenze di ricerca o didattiche. Le risorse sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.
1. Preparazione del campione e pulizia dei tessuti (6 - 10 giorni)
<ol><li>Preparare tutte le soluzioni chimiche nella tabella dei materiali necessarie per il metodo di pulizia dei tessuti prima di iniziare la procedura di pulizia dei tessuti. NOTA: Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale, soprattutto quando si maneggiano sostanze chimiche tossiche.</li>
	<li>Sopprimere gli animali con CO2 mettendoli in una camera di CO2 nei punti temporali desiderati, come P1 e 8 settimane, per la raccolta dell'intero cuore e immergere il cuore appena isolato a temperatura ambiente (RT) in 0,2 M KCl per arrestare in diastole16.</li>
	<li>Fissare il cuore immergendolo in paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con una leggera agitazione su un bilanciere durante la notte per preservare l'anatomia cardiaca a 4 °C, vedere la Tabella 1. ATTENZIONE: Il PFA è una sostanza chimica tossica e deve essere eseguito sotto una cappa aspirante.</li>
	<li>Lavare il cuore con 1x PBS a RT per 30 min, 3x. NOTA: Opzionale: incorporare il cuore nel gel di agarosio per creare un gruppo cuore per il sistema LSM personalizzato nel passaggio 2 come descritto di seguito.<ol><li>Preparare la soluzione di agarosio all'1% sciogliendo l'agarosio in PBS e scaldare la miscela nel microonde fino a completa dissoluzione. Versare la soluzione in uno stampo per creare uno strato inferiore fino a quando la soluzione non si raffredda a 40 °C.</li>
		<li>Mettere il cuore nello stampo e riempire lo stampo con gel di agarosio fino a quando non si solidifica. Eliminare eventuali bolle nel gel di agarosio per ridurre al minimo gli artefatti nell'imaging. NOTA: L'inclusione del campione riduce il rischio di potenziali danni all'anatomia del cuore durante il montaggio. ATTENZIONE: Utilizzare l'agarosio a basso punto di fusione ed evitare di mettere il cuore direttamente nell'agarosio riscaldato per mitigare il rischio di esporre il campione a temperature elevate.</li>
	</ol></li>
	<li>Disidratare il cuore utilizzando gradienti di metanolo miscelato con acqua deionizzata (Figura 1B), elaborando attraverso concentrazioni sequenziali del 20%, 40%, 60%, 80% e 100% come indicato nella Tabella 1. Ripetere con metanolo fresco al 100% 1 volta per garantire la completa disidratazione. Disidratare i cuori di topo neonatale per 1 ora in ciascuna miscela di metanolo agitando. Regolare il tempo di incubazione a 2 ore per cuori di topo e cuori di ratto di 8 settimane. ATTENZIONE: Il metanolo è una sostanza chimica volatile, irritante e infiammabile.</li>
	<li>Sostituire e raffreddare il cuore con metanolo fresco al 100% per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Sostituire la soluzione e sbiancare il cuore con perossido di idrogeno al 5% (H2O2) in metanolo utilizzando un rapporto in volume di 1:5 (30% H2O2 a 100% di metanolo) per una notte a 4 °C per rimuovere i pigmenti. NOTA: La rimozione dei pigmenti consente di ridurre al minimo l'assorbimento dei fotoni, portando a una migliore qualità dell'immagine con artefatti ridotti.</li>
	<li>Sostituire la soluzione e incubare il cuore in metanolo al 100% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Delipidate il cuore con la soluzione contenente il 66% di diclorometano (DCM) e il 33% di metanolo per 3 ore agitando. Assicurarsi che il cuore affondi sul fondo della fiala entro la fine di questo passaggio. In caso contrario, rinnovare la soluzione (66% DCM / 33% metanolo) e prolungare il tempo di incubazione (ad es. 1 ora in più) per ottenere la completa delipidazione. Trasferisci rapidamente il cuore in una soluzione fresca per evitare l'essiccazione, poiché il DCM è altamente volatile. ATTENZIONE: Utilizzare polipropilene o vetreria per l'esperimento, poiché DCM non è compatibile con il polistirolo.</li>
	<li>Utilizzare l'etere dibenzilico (DBE) per la corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI = 1,56). Per i cuori di topo neonatale, il processo di corrispondenza dell'indice di rifrazione richiede 2 giorni, mentre per i cuori di topo di 8 settimane occorrono 5 giorni con un leggero scuotimento. Sostituiscilo con DBE fresco e prolunga il tempo di incubazione fino a quando il cuore non raggiunge la completa trasparenza. ATTENZIONE: Il DBE è pericoloso. Evitare qualsiasi contatto con la pelle.</li>
</ol>2. Montaggio del campione (1 giorno)
NOTA: Nel caso in cui venga utilizzato un sistema LSM commerciale, seguire il protocollo specifico fornito dall'azienda per riparare il cuore e saltare i passaggi 2.1 - 2.9.
<ol><li>Personalizza una camera e un supporto resistenti alla soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (ad esempio, DBE nell'approccio iDISCO adattato) utilizzando una stampante 3D e materiali Onyx (Figura 2A)16.</li>
	<li>Fissare un magnete sul fondo della camera per facilitare il collegamento rapido e la localizzazione accurata sotto il sistema LSM (Figura 2B).</li>
	<li>Fissare occhiali di copertura da 25 mm x 50 mm x 0,17 mm alla camera utilizzando colla siliconica trasparente e verificare l'integrità impermeabile della camera riempiendola con DBE e verificando la presenza di perdite dopo 1 giorno.</li>
	<li>Personalizza un supporto per morsetto utilizzando una stampante 3D e apposta un magnete per montare il gruppo cuore all'interno della camera (Figura 2C) o inserire un ago nel gel di agarosio per montare il gruppo cuore.</li>
	<li>Effettuare lo sviluppo di un sistema LSM interno utilizzando una lente cilindrica e laser a stato solido pompati a diodi a onda continua (DPSS) come precedentemente riportato16,22. Utilizzare la lunghezza d'onda di eccitazione di 532 nm per catturare l'autofluorescenza dal miocardio (Figura 2D).</li>
	<li>Montare la camera su un tavolino a 6 dimensioni e individuare la posizione ottimale in cui la camera è perpendicolare alla direzione di propagazione del laser.</li>
	<li>Utilizzare un supporto a morsetto magnetico per posizionare il campione al centro della camera e collegare il supporto a un tavolino motorizzato a 4 dimensioni (X, Y, Z e Imbardata; Figura 2D).</li>
	<li>Immergere il gruppo cuore nella camera riempita di DBE utilizzando il tavolino motorizzato e determinare il raggio di scansione lungo l'asse di rilevamento (direzione Z).</li>
	<li>Determinare la velocità di scansione (V,z) del motore lungo la direzione Z in base alla dimensione del passo (S) e al tempo di acquisizione di un'immagine (T) utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: La relazione tra la dimensione del passo e la risoluzione assiale del sistema di imaging aderisce al teorema di campionamento di Nyquist-Shannon. Ad esempio, la dimensione del passo è stata fissata a 1 μm, dato che la risoluzione assiale era di 2,91 μm, come indicato nel precedente rapporto16.</li>
	<li>Per verificare la risoluzione spaziale e ridurre al minimo i potenziali problemi di opacità a diverse profondità, misurare la funzione di diffusione puntuale (PSF) del sistema mediante imaging di microsfere fluorescenti con il diametro di 0,53 μm diluite in gel di agarosio a basso punto di fusione all'1% con una concentrazione di 1:1,5 x 105. Calcolare la PSF sull'intero campione misurando l'intera larghezza a metà massimo (FWHM)16.</li>
</ol>3. Stitching dell'immagine (4-8 ore)
<ol><li>Calcola il numero di tessere necessarie per coprire l'intero cuore del mouse, considerando il FOV limitato. Per ogni piastrella, le dimensioni corrispondono al FOV del sistema LSM. Ad esempio, un cuore di topo neonatale con una sezione trasversale di 3 x 3,6 mm2 richiede 2 x 2 piastrelle per la copertura nell'LSM personalizzato (Figura 3A). Al contrario, un cuore di topo di 8 settimane che misura 5 x 8 mm2 richiede 3 x 4 tessere per coprire l'intera struttura cardiaca (Figura 3B). NOTA: Lo stitching dell'immagine è necessario se l'LSM convenzionale ha un FOV limitato per l'imaging dell'intero cuore.</li>
	<li>Cattura immagini del cuore partendo dalla tessera 1, ovvero la piastrella nell'angolo in alto a sinistra del cuore (Figura 3A-B).</li>
	<li>Acquisire in sequenza le immagini delle tessere rimanenti con una sovrapposizione del 10% tra tessere consecutive fino a coprire l'intero cuore, come illustrato nella Figura 3C.</li>
	<li>Scarica e installa il software open source Fiji23 . Scarica e installa il plug-in Fiji, BigStitcher24.</li>
	<li>Vai al menu Aiuto, seleziona Aggiorna, scegli Gestisci sito di aggiornamento e opta per BigStitcher. Successivamente, fare clic su Chiudi, quindi su Applica modifiche. Al termine del download del plug-in, riavvia il software Fiji.</li>
	<li>Apri il plug-in BigStitcher e importa tutte le tessere necessarie attraverso la directory del file immagine. Salvare il set di dati come file HDF5.</li>
	<li>Organizza le tessere scegliendo Sposta tessera per griglia normale, seleziona il motivo utilizzato per spostare il cuore e seleziona una sovrapposizione del 10% tra ogni tessera. Cucire le tessere usando l'opzione Procedura guidata di unione.</li>
	<li>Esporta i dati uniti usando Image Fusion, per generare un file tiff.</li>
</ol>4. Deconvoluzione multiview (5 giorni)
<ol><li>Utilizzare perline fluorescenti per la registrazione dell'immagine della ricostruzione multiview lungo il cuore (Figura 3D).<ol><li>Preparare la resina25 mescolando bisfenolo-A diglicidil etere (D.E.R. 332), isoforone diammina, 5-ammino-1,3,3-trimetilcicloesandmetilammina (IPDA) e propilenico glicole diglicidil etere (D.E.R. 736) con un rapporto di volume di 4:1:1.</li>
		<li>Centrifugare 10 μL di microsfere di fluorescenza a 161 x g per 5 minuti e aggiungere 20 μL di metanolo per sostituire la soluzione di conservazione delle microsfere. Ripetilo 3 volte.</li>
		<li>Preparare una soluzione da 10 mL con concentrazione di microsfere 1:1 x 105 mescolando la soluzione di microsfere a base di metanolo nella resina preparata al punto 4.1.1.</li>
		<li>Degasare la soluzione in una camera a vuoto per 3 ore per rimuovere sacche d'aria e bolle.</li>
		<li>Versare la soluzione in uno stampo in silicone o in una cannuccia di plastica e attendere 2 o 3 giorni finché non si solidifica. Dopo 1 giorno prima che la resina diventi solida, metti il tubo di vetro all'interno dello stampo e attendi che il tubo si attacchi alla resina. Rimuovere la resina dallo stampo con il tubo di vetro (Figura 3D).</li>
		<li>Metti il cuore nel tubo di vetro, riempilo di DBE e monta il tubo di vetro nella camera riempita di DBE.</li>
	</ol></li>
	<li>Acquisire immagini sequenziali del cuore del topo insieme alle perline dalla sezione illuminata scansionando il gruppo cuore lungo l'asse di rilevamento (asse Z; Figura 3E-F). NOTA: Implementa l'unione delle immagini nel passaggio 3 per generare singole pile di immagini se la dimensione del cuore supera il FOV.</li>
	<li>Ruotare il cuore del mouse di 60° lungo l'asse Y per acquisire le pile successive da più angolazioni, ad esempio 0°, 60°, 120°, 180°, 240° e 300° (Figura 3E-F).</li>
	<li>Apri il plugin BigStitcher e importa tutte le immagini attraverso la directory dei file immagine. Salvare il set di dati come file HDF5.</li>
	<li>Scegli Rileva punti di interesse e seleziona manualmente le perline di interesse per la registrazione.</li>
	<li>Selezionare Modello di trasformazione affine per la registrazione. Selezionate Funzione diffusione punti (Point Spread Function) e assegnate PSF a tutte le viste.</li>
	<li>Fare clic su Deconvoluzione multivista e scegliere il tipo di iterazione come Bayesiana efficiente. Definire Numero di iterazioni come 10 ed eseguirlo26.</li>
	<li>Fare clic su Image Fusion per esportare un file tiff . NOTA: Informazioni più dettagliate sulla deconvoluzione multiview possono essere trovate in altri rapporti o protocolli 24,27,28.</li>
</ol>5. Hardware del sistema a foglio leggero a spazzamento assiale (1 giorno)
<ol><li>Installare una lente sintonizzabile elettrica (ETL) sul piano di Fourier della lente cilindrica (CL)27 (Figura 2D) per scansionare il raggio laser assialmente14. Assicurarsi che l'interfaccia del liquido in ETL sia orizzontale per evitare la distorsione del fronte d'onda causata dalla gravità. Allineare l'ETL con precisione per ridurre al minimo il decentramento del fascio e le aberrazioni ottiche di ordine superiore30.</li>
	<li>Installare una scheda DAQ nella workstation e collegare un cavo BNC alla scheda DAQ per sincronizzare l'esposizione della telecamera e la scansione ETL.</li>
	<li>Aprire l'alloggiamento del driver ETL e rimuovere il coperchio (Figura 4).</li>
	<li>Saldare il filo del segnale del cavo BNC al pin analogico in B, come indicato nella parte inferiore della scheda PCB (Figura 4).</li>
	<li>Saldare il filo di terra del cavo BNC al pin GND; quindi collegare l'altra estremità del cavo BNC all'AO (uscita analogica) nella scheda DAQ (Figura 4).</li>
	<li>Collegare il driver ETL alla porta USB della workstation, collegare il driver all'ETL utilizzando un cavo hirose e installare il software di controllo del driver dell'obiettivo.</li>
	<li>Modificare la modalità di funzionamento nel software del controller del driver dell'obiettivo in analogico per controllare l'ETL con un trigger generato dalla scheda DAQ.</li>
	<li>Nel software della fotocamera sCMOS, impostare la modalità di acquisizione su Esterno (foglio luminoso). Assicurarsi che la direzione di scansione dei pixel attivi sia perpendicolare alla direzione di scansione laser per facilitare la sincronizzazione.</li>
	<li>Collegare la porta trigger esterna sul retro della fotocamera sCMOS all'AO della scheda DAQ utilizzando un cavo BNC (Figura 4).</li>
</ol>6. Sincronizzazione del sistema di fogli leggeri a spazzata assiale (7 giorni)
<ol><li>Definire il tempo di esposizione in base al rapporto segnale/fondo accettabile (SBR) che per lo studio proposto è almeno 10. Aumentare il tempo di esposizione se SBR è inferiore a 10. NOTA: Il tempo di esposizione compreso tra 10 e 50 ms fornisce un SBR accettabile in questo progetto.</li>
	<li>Definire il tempo di acquisizione di un'immagine (T) e l'intervallo di linea (L) in base al tempo di esposizione (E) per la fotocamera e alla frequenza ETL (f) utilizzando le seguenti equazioni: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq03.jpg" style="margin: auto;"> Dove P indica il numero di colonne di pixel sul sensore della fotocamera. I parametri rappresentativi per il riferimento sono rispettivamente f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms e L = 243 μs.</li>
	<li>Nel programma LabVIEW Trigger Generator.vi, genera trigger quadrati e triangolari per la sincronizzazione (Figura 5). NOTA: Il programma LabVIEW personalizzato è disponibile presso gli autori su ragionevole richiesta.</li>
	<li>Montare perle fluorescenti diluite in gel di agarosio 16 a basso punto di fusioneall'1% con una concentrazione di 1:1 x 103 per individuare la posizione della vita del raggio nell'immagine (Figura 6A).</li>
	<li>Nel programma, identificare i punti di inizio e fine del raggio laser sotto il FOV modificando la tensione lungo la direzione di scansione.</li>
	<li>Per sincronizzare la fotocamera sCMOS e l'ETL, scansionare il raggio laser lungo l'asse X e i pixel attivi lungo l'asse Y per generare un'immagine 2D (Figura 6B). Le perline più luminose e nitide lungo la diagonale nell'immagine indicano la precisa sincronizzazione tra sCMOS ed ETL. NOTA: La sincronizzazione della velocità di scansione dell'attivazione dei pixel ETL e sCMOS è fondamentale per la qualità dell'immagine. Vari errori asincroni comuni sono riepilogati nella Figura 6C-F.</li>
	<li>Dopo aver determinato i parametri di sincronizzazione ottimali per la sincronizzazione, ruotare la fotocamera sCMOS di 90° attorno all'asse Z per allineare la direzione dei pixel attivi con la direzione della scansione laser.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.10 e misurare l'FWHM della PSF. Utilizzare lo stesso metodo indicato nel precedente rapporto16, con le risoluzioni laterali e assiali medie dell'ASLM rispettivamente di 2,18 μm e 2,88 μm (Figura 7). NOTA: L'illuminazione e la risoluzione uniformi su tutto il FOV sono possibili in condizioni ideali (Figura 7A-B). Il funzionamento asincrono dell'ETL con la telecamera sCMOS, così come il disallineamento dell'illuminazione e del rilevamento, possono causare una risoluzione spaziale non uniforme (Figura 7C-D).</li>
	<li>Per l'imaging cardiaco, dopo aver allineato il sistema e determinato i parametri ottimali per la sincronizzazione del sistema, procedere con i passaggi da 2.6 a 2.9.</li>
</ol>

Microscopia a foglio luminoso e pulizia dei tessuti per un imaging cardiaco completo

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il progresso dei metodi di imaging, calcolo e pulizia dei tessuti ha fornito un'opportunità senza precedenti per studiare ampiamente la struttura e la funzione cardiaca. Ciò ha un grande potenziale per approfondire la nostra comprensione della morfogenesi e della patogenesi cardiaca utilizzando un modello di cuore di roditore intatto. A differenza degli studi in vivo sul cuore del pesce zebra che utilizzano un approccio simile 40,41,42,43, l'integrazione di tecniche LSM avanzate e metodi di pulizia dei tessuti...

L'insufficienza cardiaca rimane la principale causa di mortalità in tutto il mondo, principalmente a causa della mancanza di capacità rigenerativa dei cardiomiociti maturi1. L'intricata architettura del cuore svolge un ruolo cruciale nella sua funzione e fornisce informazioni sui processi di sviluppo. Una profonda comprensione della struttura cardiaca è essenziale per chiarire i processi fondamentali della morfogenesi cardiaca e del rimodellamento in risposta all'infarto del miocardio. Recenti progressi hanno dimostrato che i topi neonatali possono ripristinare la funzione cardiaca dopo una lesione, mentre i topi adulti mancano di tale capacità rigenerativa2. Ciò stabilisce una base per lo studio dei segnali associati ad anomalie strutturali e funzionali nei modelli murini. I metodi di imaging tradizionali, come la microscopia confocale, presentano limitazioni tecniche, tra cui una profondità di penetrazione limitata, uno schema di scansione a punti lento e danni fotografici dovuti all'esposizione prolungata alla luce laser. Questi ostacolano l'imaging tridimensionale completo (3D) del cuore intatto. In questo contesto, la microscopia a foglio luminoso (LSM) emerge come una soluzione potente, che offre i vantaggi dell'imaging ad alta velocità, la riduzione dei danni fotografici e le eccezionali capacità di sezionamento ottico 3,4,5. Le caratteristiche uniche dell'LSM lo posizionano come un metodo promettente per superare i limiti delle tecniche convenzionali, fornendo informazioni senza precedenti sullo sviluppo cardiaco e sui processi di rimodellamento 6,7,8.
In questo protocollo, introduciamo una strategia di imaging che combina LSM avanzato con approcci di pulizia tissutale adattati9, consentendo l'imaging di interi cuori di topo senza la necessità di una marcatura specifica e di un sezionamento meccanico. Proponiamo inoltre che l'imaging LSM convenzionale possa essere migliorato attraverso la deconvoluzione multiview10 o le tecniche di microscopia a foglio di luce a scansione assiale (ASLM) 11,12,13,14,15 per migliorare la risoluzione assiale. Inoltre, l'integrazione dell'unione delle immagini con uno di questi metodi può superare efficacemente il compromesso tra risoluzione spaziale e campo visivo (FOV), facendo così progredire l'imaging dei cuori di topo adulto. L'incorporazione di numerosi approcci di pulizia dei tessuti, inclusi metodi idrofobici, idrofili e basati su idrogel, consente una penetrazione della luce più profonda per catturare la morfologia dell'intero cuore 16,17,18,19.
Sebbene i metodi di purificazione multipli siano compatibili con gli attuali sistemi LSM, l'obiettivo è ridurre al minimo la dispersione dei fotoni e migliorare la penetrazione della luce nei tessuti, come il cuore, sostituendo i lipidi con un mezzo che corrisponda strettamente al suo indice di rifrazione. iDISCO è stato scelto come rappresentante20,21 e adattato per l'imaging in autofluorescenza in questo protocollo grazie alla sua rapida elaborazione e all'elevata trasparenza (Figura 1A). Nel complesso, l'integrazione dell'approccio LSM avanzato con le tecniche di pulizia dei tessuti offre un quadro promettente per svelare l'intricata anatomia cardiaca nei cuori dei roditori, con un potenziale significativo per far progredire la nostra comprensione della morfogenesi e della patogenesi cardiaca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

La microscopia a foglio luminoso (LSM) svolge un ruolo fondamentale nella comprensione dell'intricata struttura tridimensionale (3D) del cuore, fornendo informazioni cruciali sulla fisiologia cardiaca fondamentale e sulle risposte patologiche. Approfondiamo lo sviluppo e l'implementazione della tecnica LSM per chiarire la microarchitettura del cuore nei modelli murini. La metodologia integra un sistema LSM personalizzato con tecniche di pulizia dei tessuti, mitigando la dispersione della luce all'interno dei tessuti cardiaci per l'imaging volumetrico. La combinazione di LSM convenzionale con approcci di cucitura delle immagini e deconvoluzione multiview consente l'acquisizione dell'intero cuore. Per affrontare il compromesso intrinseco tra risoluzione assiale e campo visivo (FOV), introduciamo inoltre un metodo di microscopia a foglio luminoso a scansione assiale (ASLM) per ridurre al minimo la luce sfocata e illuminare uniformemente il cuore attraverso la direzione di propagazione. Nel frattempo, i metodi di pulizia dei tessuti come iDISCO migliorano la penetrazione della luce, facilitando la visualizzazione delle strutture profonde e garantendo un esame completo del miocardio in tutto il cuore. La combinazione dei metodi LSM e di pulizia dei tessuti proposti presenta una piattaforma promettente per i ricercatori nella risoluzione delle strutture cardiache nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

Autore in primo piano: imaging personalizzato su foglio luminoso per lo studio delle strutture miocardiche nei cuori dei roditori

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Our research aims at customizing a light-sheet imaging system to investigate the myocardial structures of the intact rodent heart at a cellular level. We have developed a workflow to explore the intact myocardium with isotropic resolution at the micron level from neonatal to adult rodent hearts. Our study fills a gap in investigating the intricate myocardial microstructures, such as trabeculation, inside the intact ventricles, with high spatial resolution.This imaging strategy provides an entry point to assess microstructure without physical slicing, leading to an enhanced understanding of cardiac development and remodeling. We will concentrate on exploring the structural changes of the myocardium in response to cardiac injury and remodeling.

È stato dimostrato che LSM favorisce gli studi cardiaci 31,32,33,34,35,36,37 a causa del rischio minimo di danni fotografici, dell'elevata risoluzione spaziale e del sezionamento ottico rispetto ad altri metodi di imaging ottico come le tecniche di scansione in campo chiaro <sup class="xref...

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Il protocollo utilizza la microscopia avanzata a foglio di luce insieme a metodi di pulizia dei tessuti adattati per studiare strutture cardiache complesse nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

La nostra ricerca mira a personalizzare un sistema di imaging a foglio luminoso per indagare le strutture miocardiche del cuore di roditore intatto a livello cellulare. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per esplorare il miocardio intatto con risoluzione isotropa a livello di micron dai cuori di roditori neonatali a quelli adulti. Il nostro studio colma una lacuna nello studio delle intricate microstrutture miocardiche, come la trabecolazione, all'interno dei ventricoli intatti, con un'elevata risoluzione spaziale.Questa strategia di imaging fornisce un punto di ingresso per valutare la microstruttura senza affettatura fisica, portando a una migliore comprensione dello sviluppo e del rimodellamento cardiaco. Ci concentreremo sull'esplorazione dei cambiamenti strutturali del miocardio in risposta al danno cardiaco e al rimodellamento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

578 Views.  The University of Texas at Dallas. La nostra ricerca mira a personalizzare un sistema di imaging a foglio luminoso per indagare le strutture miocardiche del cuore di roditore intatto a livello cellulare. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per esplorare il miocardio intatto con risoluzione isotropa a livello di micron dai cuori di roditori neonatali a quelli adulti. Il nostro studio colma una lacuna nello studio delle intricate microstrutture miocardiche, come la trabecolazione, all'interno dei ventricoli intatti, con un'el...

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Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.