Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive un metodo per generare una popolazione ben caratterizzata di cellule endoteliali emogeniche umane. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare la regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica. Inizia coltivando cellule staminali embrionali umane per quattro giorni per differenziarle in cellule endoteliali primordiali.

Il quinto giorno, aspirare il mezzo sopra le cellule. Quindi lavare delicatamente le cellule con un millilitro di DMEM / F-12 per pozzetto. Aggiungere un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Il sesto e il settimo giorno, sostituire il mezzo sopra le cellule con un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali omogenee appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per altre 24 ore. L'ottavo giorno. Dopo aver staccato e lavato le celle, dividerle uniformemente in provette da microcentrifuga su ghiaccio, ciascuna contenente un minimo di 600 microlitri di cellule ad una densità di 1 volte 10 alle 5 celle per millilitro.

Aggiungere anticorpi alle provette contenenti le cellule come appropriato e incubare su ghiaccio protetto dalla luce per 30 minuti. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 1000 volte G e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone di selezione ghiacciato.

Filtrare i campioni attraverso il tappo filtrante a rete di tubi FACS da cinque millilitri e conservare le celle su ghiaccio al riparo dalla luce per la selezione immediata delle cellule. Per isolare le cellule endoteliali emogeniche mediante FACS, prima eliminare la popolazione cellulare CD45-negativa. Quindi, all'interno della popolazione CD45-negativa, le cellule CD31-positive.

Successivamente all'interno della popolazione CD31-positiva, porta per la popolazione cellulare VE-caderina-negativa. E poi all'interno della popolazione VE-caderina-negativa, porta per le cellule c-Kit-positive. Dalla popolazione c-Kit-positiva, porta la popolazione cellulare CD34-positiva.

E infine dalla popolazione cellulare CD34-positiva, identificare e raccogliere le cellule KDR-positive. Dopo aver seminato cellule endoteliali emogeniche in un mezzo a base di metilcellulosa formulato per la crescita di cellule progenitrici ematopoietiche, le colonie di unità eritroidi formanti colonie e unità eritroidi formanti esplosione vengono contate l'ottavo giorno. Unità formante colonie-granulociti-macrofagi e unità formanti colonie-granulociti, eritroidi, macrofagi e megacariociti.

Le colonie progenitrici ematopoietiche multipotenti vengono contate il giorno 14. Per 1000 cellule endoteliali emogeniche placcate, vengono generate circa 20 unità formanti colonie. Nelle colture sono visibili anche cellule con morfologia cellulare endoteliale.

Queste sono le cellule endoteliali emogeniche che danno origine a progenitori ematopoietici multilineare a livello unicellulare. Questo protocollo è un sistema di coltura 2D privo di siero e alimentatore murino in grado di generare cellule endoteliali emogeniche umane in circa una settimana.