Il nostro metodo mira a generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco dalle cellule staminali embrionali del topo. Questa linea di cellule staminali reporter del campo cardiaco consente lo studio ad alta produttività dei meccanismi alla base delle malattie cardiache congenite, fornendo un sistema suscettibile di manipolazione genetica e farmacologica. Ci sono diverse malattie cardiache congenite specifiche della camera.
Ricapitolando la cardiogenesi in vitro, questo protocollo consente lo studio del meccanismo della malattia e lo sviluppo di future terapie rigenerative. Questo protocollo può fornire informazioni su come vengono specificate cellule progenitrici cardiache di diverse camere durante lo sviluppo cardiaco. Inizia coltivando cellule staminali embrionali di topo transgeniche in matracci T25 rivestiti di gelatina dello 0,1% in mezzo 2i.
Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, sciacquare le colture con PBS e aggiungere un millilitro di tripina per pallone per dissociare la coltura in singole cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la reazione con quattro millilitri 10 FBS in DMEM e contare le cellule con un metodo appropriato. Diluire le cellule a circa tre volte 10 fino alle cinque cellule per concentrazione media fresca e raccogliere le cellule per centrifugazione.
Quindi riutilizzarlo in cinque millilitri di mezzo 2i fresco per la piastra su nuovi contenitori T25 rivestiti in gelatina allo 0,1%. Per la generazione di CPC dagli sferoidi cardiaci, raccogliere 2,5 per 10 a sei del campione di cellule staminali embrionali di topo transgenico staccato per centrifugazione e rimorsinare le cellule in 25 millilitri di mezzo SFD. Placcare la sospensione cellulare in una piastra sterile da 150 per 25 millimetri per l'incubazione a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 48 ore.
Alla fine dell'incubazione, raccogliere gli sferoidi cardiaci in un tubo conico. Sedimentare gli sferoidi mediante centrifugazione per facilitare l'isolamento selettivo degli sferoidi ed evitare singole cellule. Resopend gli sferoidi in 25 millilitri di mezzo SFD fresco integrato con un nanogrammo per millilitro di attivina A e 1,5 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea quattro.
Riprotere gli sferoidi sulla stessa piastra di coltura per un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare. Il giorno dopo, ricorda tutti gli sferoidi cardiaci per centrifugazione. Rimospendare i corpi embrionale differenziati in 25 millilitri di mezzo SFD fresco per la placcatura in un attacco ultra-basso, pallone quadrato di 75 centimetri nell'incubatore di coltura cellulare per 48 ore.
Per l'isolamento del CPC specifico del campo cardiaco utilizzando reporter fluorescenti, raccogliere i corpi embriopi per centrifugazione e dissociare le colture 3D con un millilitro di tripside a 37 gradi Celsius per tre minuti. Al termine dell'incubazione, mescolare bene con pipettazione per dissociare le cellule e neutralizzare la reazione con quattro millilitri del 10%FBS in DMEM. Passare la miscela su un colino di 70 micrometri per rimuovere eventuali corpi embrionali non dissociati e sedimentare le cellule filtrate mediante centrifugazione.
Per ordinare i CPC in base alla loro espressione di reporter fluorescente, risosospendare il pellet in soluzione FACS da 500 microlitri e filtrare le celle attraverso un colino cellulare di 40 micrometri in un tubo a fondo rotondo in polistirolo da cinque millilitri sul ghiaccio. Quindi ordinare le celle per isolare le cellule che esprimono RFP e GFP tramite FACS, raccogliendo le cellule in un millilitro di FBS. Per isolare i CPC del primo rispetto al secondo campo cardiaco in base alla loro espressione Cxcr4 della proteina superficiale, rimescolare le cellule progenitrici cardiache a cellule staminali embrionali a singola topo che esprimono RFP in 300 microlitri del 10%FBS in PBS integrati con anticorpi anti-Cxcr4 coniugati con fluorescenza.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule tre volte in uno o due millilitri di PBS fresco e freddo per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare le cellule in 500 microlitri di soluzione FACS e filtrare le celle attraverso un colino di 40 micrometri in un tubo a cinque millilitri, a fondo tondo. Quindi ordinare le cellule in base alla loro espressione Cxcr4, raccogliendo sia le popolazioni Cxcr4-positive che negative in singoli tubi contenenti un millilitro di FPS per tubo su ghiaccio.
Per ricolturare le cellule progenitrici cardiache isolate dal FACS, specifiche del campo cardiaco, raccogliere le cellule ordinate per centrifugazione e rimorsire il pellet nel mezzo SFD. Quindi seminare circa tre volte 10 alle quattro cellule per pozzo in una piastra ricoperta di gelatina dello 0,1%, 384 po '. Se si nota un aumento della morte cellulare dopo lo smistamento, aggiungere un inibitore ROCK a 10 micromolare ad ogni pozzo.
Dopo due giorni di cultura, si dovrebbe osservare il pestaggio spontaneo. Per analizzare la capacità dei CPC placcati di differenziarsi dai cardiomiociti, raccogliere le cellule al giorno 12 di differenziazione con tripside, come dimostrato, per isolare i singoli cardiomiociti e resospedere le cellule in paraformaldeide al 4%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule fisse per centrifugazione e lavare il pellet in PBS per rimuovere l'eccesso fissativo.
Successivamente, resospendare le cellule in 10%FBS in PBS, e incubare metà del campione cellulare con anticorpo T anti-troponina del topo e utilizzare l'altra metà del campione come controllo negativo. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule due volte in PBS fresco e rimorsi i campioni in 10%FBS più PBS integrati con un anticorpo secondario appropriato. Dopo un'altra incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule due volte in PBS fresco per lavaggio e rimescolare le cellule in 200 microlitri di PBS per tubo per l'analisi su un citometro a flusso.
Dopo circa 132 ore di differenziazione, le cellule progenitrici cardiache Tbx1-RFP e Hcn4-GFP possono essere rilevate mediante microscopia a fluorescenza. Generalmente, sia le cellule GFP che RFP appaiono approssimativamente nello stesso periodo, e le due popolazioni di cellule progenitrici continuano ad espandersi in prossimità e in genere in un modello complementare. La regolazione delle concentrazioni di attivina A e proteina morfogenetica ossea quattro altererà le percentuali delle cellule progenitrici cardiache del primo rispetto al secondo campo cardiaco.
Allo stesso modo, utilizzando una linea di cellule staminali embrionali di topo reporter RFP, dopo 132 ore di differenziazione, compaiono cellule progenitrici cardiache positive alla RFP. Dopo l'immunosottenzione per cellule Cxcr4, RFP-positive, Cxcr4-positive e RFP-positive, le cellule Cxcr4-negative possono essere isolate. L'immunostaining per la troponina cardiaca T al giorno 12 della differenziazione conferma che le prime cellule del campo cardiaco si differenziano principalmente in miociti.
Allo stesso modo, le cellule derivate da cellule progenitrici cardiache positive rfp, Cxcr4-negative danno origine a cardiomiociti a percentuali molto più elevate rispetto alle singole cellule progenitrici cardiache positive Cxcr4. Occasionalmente, le cellule staminali embrionali del topo non riescono a differenziarsi in modo efficiente e formano un numero molto basso di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco. La tempistica, la concentrazione e la consistenza dell'aggiunta delle citochine e il numero delle cellule sono fondamentali per una generazione riuscita di cellule progenitrici cardiache specifiche della camera.
Seguendo questa procedura, gli investigatori possono analizzare le proprietà fisiologiche delle diverse popolazioni di cellule progenitrici cardiache per ottenere ulteriori informazioni sulle loro specifiche e funzioni.
