Il vantaggio principale di questa tecnica di coltivazione è che è possibile ottenere copepodi vergini controllando la loro esperienza di accoppiamento e monitorandone lo sviluppo. Il seguente metodo di analisi del comportamento può aiutare esperimenti controllati e riproducibili sul comportamento di protezione del mate dei copepodi Tigriopus che sono comuni zooplancton nelle pozze di marea rocciose. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sul comportamento riproduttivo del Tigriopus, possono anche essere usati per esaminare come i fattori genetici e ambientali influenzano la fisiologia e il comportamento di questi copepodi.
Per iniziare, usa una pipetta Pasteur per raccogliere femmine gravide che trasportano uova d'arancia chiare dalla coltura stock. Risciacquare le femmine con un mezzo di coltura pulito tramite pipettazione delicata. Quindi, posizionare ogni femmina in un pozzo individuale di una piastra di coltura cellulare a sei pozzi con mezzo di coltura pulito.
Quindi posizionare il piatto in un'incubatrice per coltura delle femmine fino a quando non rilasciano sacche di uova. Dopo che le sacche di uova sono state rilasciate, utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere le femmine dai pozzi del piatto. Non appena gli animali nella prima fase copepodide o CI iniziano ad emergere, utilizzare una micropipetta P-10 per raccoglierli.
Ogni due o tre giorni, monitora i pozzi per le exuviae fuse. Dopo questo, sesso con gli animali esaminando la loro morfologia dell'antenna. Per identificare correttamente le femmine adulte, assicurarsi che abbiano già fuso cinque esuviae nei pozzi di coltura perché le differenze nella forma delle antenne tra femmine adulte e giovani non sono visibilmente significative in alcune popolazioni.
Dopo aver selezionato gli animali della fase e del sesso appropriati, nutrire gli individui selezionati con cibo per pesci finemente macinato. Mentre gli animali mangiano, prepara due piastre di coltura cellulare a fondo piatto da 48 po 'come camere di prova. Dopo 30 minuti, sciacquare ogni animale in un susseguirsi di quattro pozzi di una piastra di 24 po 'piena di acqua di mare artificiale pulita.
Quindi posizionare gli individui risciacquati nei pozzi delle piastre A e B sul light pad a LED. Lasciare che gli animali si acclimatino per 30 minuti, quindi utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire i bersagli dalla piastra B alla piastra A.Consentire a un maschio e a un bersaglio di interagire in ogni pozzo per il tempo di osservazione designato prima di interrompere la registrazione video. In primo luogo, esaminare il video per la tempistica in cui ogni bersaglio è stato trasferito in un pozzo sulla piastra A.Next, definire l'inizio di un tentativo di guardia da parte di un maschio come un contatto dell'antenna del maschio con qualsiasi parte del corpo del bersaglio.
Definire la fine del tentativo di guardia da parte di un maschio come punto in cui entrambe le antenne del maschio si staccano dal corpo del bersaglio. Quindi, definire l'inizio della copulazione da una curva del corpo dorsale di un maschio, seguita da una pressa ripetitiva dell'urosoma contro quella della femmina. Per prima cosa, genera un video clip con l'episodio di interesse tagliando il film con il software di editing cinematografico.
Quindi, apri ImageJ e importa il video clip. Selezionare l'opzione di scala di grigi covert a 8 bit per ridurre la memoria necessaria per l'elaborazione delle immagini. Selezionare quindi lo strumento di selezione della linea retta per la calibrazione ziale e disegnare una linea di selezione lungo il diametro del pozzo.
Aprite il menu imposta scala (Set Scale) e immettete la lunghezza nota nella casella di distanza nota e l'unità nella casella unità di lunghezza. Successivamente, aprite il menu delle proprietà e immettete l'intervallo di fotogrammi nella casella intervallo fotogrammi. Aprire il plug-in MTrackJ selezionando plugin e MtrackJ.
Quindi, fare clic sul pulsante di rilevamento nella finestra di dialogo per aprire il menu di configurazione del rilevamento. Selezionare Applica aggancio cursore locale durante la traccia e selezionare il baricentro scuro come feature di aggancio. Fare quindi clic sul pulsante Aggiungi nella finestra di dialogo MTrackJ per avviare il rilevamento.
Posizionare un cursore per coprire le persone nel video clip da tenere traccia. Quindi, fare clic per rilevare il baricentro scuro dell'oggetto all'interno del quadrato. Per generare una tabella dati, fate clic sulla tabella di misura nella finestra di dialogo MTrackJ, quindi fate clic sul pulsante filmato per generare un filmato con la traiettoria tracciata disegnata come linea colorata.
Infine, fate clic sul pulsante Salva (Save) nella finestra di dialogo MTrackJ per salvare i risultati, inclusi i dati nella traiettoria bidimensionale tracciata. In questo esperimento, è stato registrato e osservato un comportamento di protezione del compagno dei copepodi tigrini. L'analisi mostra una differenza nella durata media dei tentativi di guardia tra coppie maschio-femmina e coppie maschio-maschio del Tigriopus californicus dove i maschi nelle coppie maschio-maschio mostravano una durata dei tentativi relativamente più breve rispetto a quelli delle coppie maschio-femmina.
Il tracciamento spaziale a due dimensioni di coppie di guardia appena formate di Tigriopus californicus ha rivelato che le coppie maschio-maschi tendevano a mostrare una velocità più elevata rispetto alle coppie maschio-femmina nei primi tre secondi di tentativi di guardia. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi dell'etologia, biochimica e genetica evolutiva per esplorare il sistema di accoppiamento unico di questo tipo di copepodi.
