Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze enteriche e nella fisiologia gastrointestinale, come, quali sono i meccanismi di eccitabilità delle cellule enterocromaffini e risposta agli stimoli luminali e quali sono i meccanismi del rilascio dell'ormone gastrointestinale? Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di studiare in dettaglio le cellule enterocromaffini utilizzando tecniche a cella singola, come l'elettrofisiologia. A dimostrare la procedura saranno i co-primi autori Kaitlyn Knutson e Peter Strege, gli eccezionali tecnologi che hanno sviluppato queste tecniche.
Per iniziare questa procedura, posizionare un ago della siringa da sei millilitri riempito con PBS ghiacciato nel lume del segmento intestinale estratto. Utilizzare le pinze di microdisezione, bloccare e sigillare l'intestino attorno all'ago della siringa e sciacquare delicatamente sei millilitri di PBS attraverso il lume per risciacquare qualsiasi materia fecale. Successivamente, invertire il tessuto intestinale tessendo delicatamente le pinasi della microdisezione attraverso il lume, pizzicando una parete intestinale e ritraendo il tessuto prossimale alla punta delle pinie.
Ripetere questo processo fino a quando il segmento non è all'interno e all'esterno con il lume rivolto verso l'esterno. Usando le forbici a microdisezione, tagliare i segmenti di tessuto in pezzi di un centimetro. Quindi trasferire i segmenti di tessuto in un becher da 50 millilitri riempito con cinque millilitri di PBS sterile.
Successivamente, tritare i pezzi di tessuto a una consistenza liqueficata. Trasferire il tessuto tritato e 15 millilitri di PBS ghiacciato in un tubo pulito da 50 millilitri. Triturato due volte con la pipetta di trasferimento.
Aspetta che il tessuto si sistemi. Successivamente, rimuovere 15 millilitri del supernatante PBS e sostituirlo con PBS fresco. Ripetere questo processo tre volte, fino a quando il PBS non è chiaro.
Per la prima digestione, dal bagno d'acqua, recuperare uno dei tubi da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di mezzi di digestione pre-riscaldati. Successivamente, aggiungere 250 microlitri della soluzione di collagenasi PBS nel tubo con i pezzi intestinali tritati. Infine, i pezzi di tessuto intestinale tritati sono stati aggiunti al supporto di digestione e alla soluzione di collagenasi PBS.
Quindi, posizionare il campione in un bagno d'acqua per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Titolare lentamente il tessuto una volta con una pipetta sierologica da 10 millilitri e lasciare brevemente depositare i pezzi di tessuto. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere 10 millilitri del supernatante.
Per la seconda digestione, aggiungere 250 microlitri della soluzione di collagenasi PBS al tessuto e posizionare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Successivamente, titolare lentamente la soluzione una volta con una pipetta sierologica da 10 millilitri. Quindi rimuovere 10 millilitri del supernatante.
Per la terza digestione, aggiungere 250 microlitri della soluzione di collagenasi PBS nel tubo. Mettilo in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per 10 minuti. Quindi scuotere il tubo da due a tre volte al minuto a un'intensità maggiore rispetto alle digestione una e due.
Successivamente, pipettare lentamente il tessuto su e giù con una pipetta sierologica da 10 millilitri e consentire ai pezzi di tessuto di depositarsi per un breve periodo. Trasferire 10 millilitri del supernatante in un nuovo tubo da 15 millilitri. Aggiungere due millilitri di supporti di coltura completi di cellule EC riscaldati e invertire una volta per mescolare.
Quindi, ruotare il campione a 100 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet rimanente in 2,5 millilitri di supporti di coltura completi di cellule EC riscaldate. Per la quarta digestione, ripetere le procedure di digestione, ma aumentare il tempo di incubazione di 15 minuti per il colon e rimanere a 10 minuti per il giunone.
Per coltura delle cellule, utilizzare una pipetta di trasferimento per combinare le sospensioni cellulari raccolte dalle digestione tre e quattro in un nuovo tubo da 15 millilitri. Rimuovere un'aliquota di 10 microliter di cellule e contare con un emocitometro. Quindi ruotare la sospensione cellulare rimanente a 100 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo cinque minuti, rimuovere il supernatante e aggiungere il supporto di coltura completo della cella EC utilizzando una pipetta sierologica da 5 millilitri ad una densità di un milione di cellule per millilitro. Sospendere di nuovo il tessuto utilizzando una pipetta di trasferimento. Successivamente, rimuovere i piatti di coltura rivestiti con fondo di vetro dall'incubatore.
Utilizzando una pipetta P1000, sostituire la matrice cellulare extra da ogni piatto di coltura con 250 microlitri della sospensione cellulare finale. Per ottenere un gigaseal a celle intere, abbassare l'elettrodo nella soluzione del bagno. Con il micromanipolatore, manovrare la punta dell'elettrodo in piano con e direttamente orizzontale dalla cella.
Quindi espellere 0,2 millilitri d'aria dalla siringa. Spostare delicatamente l'elettrodo orizzontalmente lungo l'asse X per toccare la cella. Guarda che una fossetta appaia sulla cellula CE e un aumento della resistenza alla membrana nei test di tenuta.
Applicare da 0,1 a 0,2 millilitri di aspirazione sulla siringa e tenere fermo lo stantuffo fino a raggiungere 100 mega-ohm. Quindi rilasciare l'impugnatura dallo stantuffo. Attendere che la cella sia gigaseale.
Quindi scollegare delicatamente la siringa. Per registrare la corrente di sodio gated di tensione a celle intere, applicare un rapido tocco di aspirazione su una siringa. Ripetere fino a ottenere l'accesso a tutta la cella prima di scollegare delicatamente la siringa.
Quindi, attivare la compensazione della capacità dell'intera cella e regolare la capacità e la resistenza in serie. Attivare la compensazione della resistenza in serie. Con un ritardo impostato a 60 microsecondi, regolare la compensazione della resistenza in serie e chiudere il test di tenuta.
Registrare una media di cinque corse di corrente di sodio a tensione-gate a celle intere. Prendi rapidamente nota di due parametri della corrente di sodio gated di tensione:La tensione alla corrente della finestra e la densità di corrente di sodio di picco. Per registrare i potenziali di azione suscitati, passare dalla pinza di tensione al morsetto di corrente.
Caricare il protocollo di morsetto di corrente episodico. Regolare la corrente di attesa a zero picoamp qui e attivare il comando esterno. Registrare i potenziali di azione suscitati.
Si noti la minima quantità di corrente iniettata per sparare un potenziale d'azione. Per registrare potenziali di azione spontanea, disattivare il comando esterno. Caricare un protocollo di morsetto di corrente privo di gap.
Modificare la corrente di attesa in base alla quantità di corrente iniettata nell'ultima sweep nel protocollo elicitato che non ha espulso un potenziale di azione. Successivamente, attivare il comando esterno. Ricontrolla che la corrente di tenuta prevista porti il potenziale della membrana al di sotto della soglia per sparare un potenziale d'azione.
Regolare la corrente di tenuta se necessario e registrare l'attività spontanea. Le colture ottimizzate per l'elettrofisiologia consistevano in singole cellule e piccoli grumi con un luminoso segnale CFP. Quando le condizioni di coltura non sono state ottimizzate, la coltura cellulare epiteliale consisteva di grandi grumi, detriti cellulari galleggianti, membrane danneggiate e debole segnale CFP nelle cellule CE.
Le cellule intere CE sono state ottenute con il 30% più o meno il 7% dei tentativi da colture del colon e il 41% più o meno il 3% dei tentativi dalla cultura del giunone. Per elettrofisiologia a cellule intere, le correnti di sodio sono state registrate da 81,3 più o meno il 4,0% delle cellule positive CPF TPH-1 dal jejunum e il 64,1 più o meno il 9,2% di esse dal colon. Di 59 cellule EC provenienti da colture di jejunum, 19 cellule EC in modalità clamp corrente hanno sparato AP spontaneo, 29 cellule EC hanno sparato AP solo quando sono state suscitate da un protocollo passo in modalità clamp corrente e 11 cellule EC non hanno sparato AP spontaneamente o tramite protocollo passo.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il protocollo di digestione ottimale per le colture epiteliali primarie può essere variabile tra un uso e l'altro, quindi è importante determinare la quantità ottimale di agitazione per ottenere singole cellule. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la PCR a singola cellula e la fluorescenza, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come ciò che le cellule enterocromaffini esprimono e come gli stimoli sono accoppiati alla segnalazione intercellulare. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alle ricerche sulla fisiologia gastrointestinale per esplorare come funzionano le cellule enterocromaffini e come regolano la motilità gastrointestinale e la secrezione nei topi.
