Presentiamo un metodo per l'analisi delle immagini dal vivo dell'assorbimento del colesterolo LDL in vari tipi di cellule umane. Ciò consente di schermare per i composti, che modificano il trasporto del colesterolo LDL. Il principale vantaggio dell'utilizzo dell'imaging a cellule vive per la quantificazione dell'afflusso di LDL è che consente di monitorare la morfologia delle cellule per tutta la durata del test, quindi potenzialmente i composti tossici possono essere rilevati.
Per iniziare, aspirare il supporto dalle cellule precedentemente preparate e lavare le cellule con 5 millilitri della salina tamponata di fosfato di Dulbecco. Aspira il DPDS. Accanto a scollegare le celle dal piatto da 100 millimetri, aggiungere 1,5 millilitri dello 0,25% trypsin-EDTA per le celle HepG2 e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione 0,05%Trypsin-EDTA per le celle HK2 o gli HCAEC.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi neutralizzare la tripparina aggiungendo 3 millilitri di supporti completi per le celle HepG2 e HCAEC. Utilizzare 3 millilitri della soluzione neutralizzante della tripsiderina, compromettere il DPDS con siero bovino fetale al 5% o FBS per le cellule HK2.
Trasferire le celle in tubi conici da 15 millilitri, quindi centrifugare i tubi a 250 g per cinque minuti. Dopo lo spin, aspirare il supporto e rimorsi il pellet di cella in un supporto completo. Filtrare delicatamente le sospensioni delle cellule attraverso un filtro a rete da 40 micron per rompere i grumi cellulari.
Contare le cellule e placcarle in una densità ottimizzata in una piastra da 24 pozze. Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi celsius per consentire alle cellule di attaccarsi. Il giorno successivo, modificare il supporto cellulare sul supporto di base senza FBS per la linea cellulare, più il 5% di siero carente di lipoproteina o il 2% di supporti FBS.
Utilizzare 500 microlitri di supporti totali per pozzo in una piastra da 24 porri. Quindi continuare l'incubazione per 24 ore per morire di fame le cellule. Insieme alla fase di fame o al giorno successivo, le cellule possono essere trattate con composti desiderati e controlli appropriati.
24 ore dopo la fame, aggiungere 5 microlitri di PHrodo rosso etichettato LDL ad ogni pozzo contenente 500 microlitri di supporti per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Rimuovere con cura eventuali bolle dai pozzi. Subito dopo aver aggiunto l'LDL etichettato, posizionare la piastra nell'incubatore del sistema di analisi delle cellule vive e lasciare che la piastra equilibra per 15 minuti per ridurre la condensa nella piastra.
Mentre le cellule stanno incubando, aprire il software e pianificare la scansione aggiungendo il recipiente che tiene la piastra. Immagine 16 immagini per pozzo, aggiungi intervalli di un'ora con ingrandimento 10x per quattro ore usando i canali rosso e di fase. Quindi creare una mappa della piastra da utilizzare per l'elaborazione dei dati, selezionare la scheda delle proprietà e scegliere la mappa della piastra.
Immettere il tipo di cella nella scheda celle e i trattamenti nel rubinetto composto. Quindi fare clic sulla scheda Aree, selezionare ogni set di repliche e assegnare aree. Una volta completata un'esecuzione sperimentale, creare un set di immagini nel software per addestrare il computer a quantificare ogni parametro incluso nel set di conteggio.
Nel software aprire la visualizzazione piastra, quindi nella casella utilità processo di analisi scegliere crea o aggiungi alla raccolta di immagini. Selezionare una nuova raccolta di immagini, digitare un nome per la raccolta di immagini e scegliere i canali rosso e di fase selezionando le caselle accanto ai canali. Seleziona altre cinque immagini da pozzi e punti di tempo diversi e aggiungile alla raccolta di immagini aggiungendole alla raccolta di immagini corrente.
Nella casella Utilità processo di analisi scegliere nuova definizione di elaborazione, selezionare la raccolta di immagini dal menu a discesa, immettere i parametri per il tipo di celle. Nella casella di anteprima usare il menu a discesa per selezionare anteprima tutto. Nella casella maschera analisi selezionare la maschera di confluenza e le caselle maschera oggetto rosso per visualizzare l'area inclusa nell'analisi per la definizione di elaborazione.
Scorrere la raccolta di immagini per assicurarsi che le celle e l'LDL siano inclusi nella maschera. Selezionare il file e salvare la definizione di elaborazione. Quindi, aprire la vista piastra di esperimento per analizzare l'insieme di immagini della corsa sperimentale.
Nella casella Utilità processo di analisi scegliere avvia nuovo processo di analisi e selezionare la definizione di elaborazione salvata. Assegnare al processo di analisi il nome, scegliere l'intervallo di tempo per l'analisi ed evidenziare i pozzi sperimentali da analizzare. Selezionare il pulsante di avvio.
Una volta completato il processo di analisi, esportare i dati, selezionare l'analisi completata e premere visualizza. Nel menu utilità scegliere esporta grafico metrico. Nel menu aree scegliere tutti i pozzi e nel menu gruppo, per ottenere il valore medio per ogni insieme di pozzi come gruppo, scegliere repliche.
E per esportare i singoli valori per ogni pozzo, non sceglierne nessuno. Nel menu metrico dell'oggetto rosso, scegliete l'intensità integrata totale dell'oggetto rosso. Selezionare il pulsante di esportazione dei dati.
Controlla suddividi i dati in singole immagini. I dati vengono copiati automaticamente in uno Appunti e possono essere incollati in un nuovo file di foglio di calcolo. Nel menu metrico dell'oggetto fase scegliere la confluenza, quindi fare clic sul pulsante di esportazione dei dati.
Nella scheda prompt controllare suddividi i dati in singole immagini. I dati vengono copiati automaticamente in uno Appunti e possono essere incollati nel file del foglio di calcolo contenente i dati di intensità integrati dell'oggetto rosso totale. Ora i dati esportati possono essere normalizzati, secondo i passaggi 4.1.7 e 4.1.8 del protocollo, per ottenere un valore finale di assorbimento LDL.
Dopo il trattamento con Dynasore o PCSK9 ricombinante, tutte e tre le linee cellulari umane testate hanno mostrato riduzioni significative dell'afflusso di LDL in un corso di quattro ore. Gli afflussi di LDL si sono ridotti nel carcinoma epatico umano o nelle cellule HepG2, con trattamento del Dynasore nel corso del tempo, rispetto alle cellule trattate con DMSO come controllo. L'imaging a cellule vive dell'afflusso di LDL nelle cellule HepG2 in diversi punti di tempo ha mostrato un aumento del mercato nell'assorbimento di LDL dopo il trattamento con Simvastatin che supporta la sensibilità di questo metodo per rilevare alterazioni significative nell'afflusso di LDL.
Le immagini in tempo reale studiate nel punto di tempo iniziale e nel punto finale, confermano la morfologia normale delle cellule dopo il trattamento di Dynasore, indicando l'efficacia e la sicurezza di questo composto. Dopo aver aggiunto un ulteriore LDL etichettato in rosso alle cellule per preservare la sua attività fluorescente, è importante proteggere la piastra dalla luce fino a quando non viene posizionata nell'incubatore del sistema di imaging a celle vive. Le cellule di organi diversi possono rispondere in modo diverso ai trattamenti, il che significa in direzioni opposte, oppure possono rispondere nelle stesse direzioni ma mostrare diversi tassi di cambiamento nell'assorbimento del colesterolo.
Solo con l'imaging delle cellule vive tali differenze possono essere rilevate e quantificate con precisione.
