Questo metodo può aiutare a classificare i sottotipi neuronali ed estendere la nostra comprensione della mappa funzionale dei circuiti corticali. Questo protocollo è stato ottimizzato per preservare l'ultrastruttura dei neuroni e ottenere un eccellente recupero di pergolati dendritici e assonali, consentendo ricostruzioni di alta qualità. Al termine di una registrazione elettrofisiologia, trasferire la fetta contenente la cella registrata in un piccolo piatto di ACSF.
Mentre si lavora in una cappa aspirante, arrotolare la fetta su un piccolo pezzo di carta da filtro di alta qualità e posizionare un altro pezzo di carta filtrante inumidita sulla fetta. Mettere il tessuto in una piccola pentola di plastica contenente da 5 a 10 millilitri di soluzione fissante e conservare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, trasferire il tessuto dal contenitore con soluzione fissante in un contenitore con due millilitri di tampone di fosfato molare 0,1 per risciacquare e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso con una lama bisturi.
Rimuovere il tessuto in eccesso posizionando la fetta in una piastra di Petri e tagliare il tessuto in eccesso con una lama bisturi. Trasferire il tessuto tagliato in una piastra di Petri pulita, assicurandosi che giace piatto senza pieghe o pieghe. Rimuovere il tampone in eccesso utilizzando un pennello asciutto.
Coprire il tessuto con una soluzione di gelatina calda e posizionare la piastra di Petri su un blocco congelato per raffreddare rapidamente la soluzione. Quindi, spostare il piatto di impostazione della gelatina a 4 gradi Celsius per 30-60 minuti. In una cappa aspirante, utilizzare una lama bisturi per tagliare un piccolo blocco di 1 X 1 centimetro contenente il tessuto incorporato di gelatina.
Sollevare il blocco utilizzando una piccola spatola e trasferirlo con cura in una soluzione fissante fresca. Lasciare fissare per almeno 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo questa seconda fissazione, lavare il blocco di gelatina in cinque millilitri di PB tre volte.
Dopo il lavaggio, asciugare il blocco usando un pezzo di tessuto di carta. Quindi utilizzare una piccola quantità di colla cianoacrilato per attaccare il blocco, orientato con il tessuto nella parte superiore, su un camion vibratomo usando super colla. Sezionare la fetta con uno spessore di 50 micron utilizzando un vibratomo e posizionare accuratamente ogni sezione in una fiala di vetro contenente il 10% di saccarosio.
Dopo aver sessato, raccogliere con cura una sezione dal flaconcino e posizionarla piatta in un coperchio della piastra di Petri. Quindi utilizzare una lama di bisturi fresca per rimuovere la gelatina da tutta la sezione. Mettere le sezioni in una fiala contenente 2 millilitri di saccarosio fresco al 10% in PB e agitare per 10 minuti per iniziare il processo di crioprotezione.
Dopo la crioprotezione, posizionare le sezioni piatte su un piccolo rettangolo di foglio di alluminio utilizzando un pennello. Rimuovere il liquido in eccesso dalle sezioni e piegare con cura il foglio in un pacco. Tenere il foglio di alluminio vicino alla superficie dell'azoto liquido senza toccare la superficie per 30 secondi.
E poi lasciare che le sezioni si scongelino completamente per circa 30 secondi. Ripetere il congelamento scongelare altre due volte. Rimuovere tutte le sezioni dal foglio con un pennello e posizionarle in una fiala di vetro contenente due millilitri di PB per lavare via il saccarosio in eccesso sotto costante agitazione.
Dopo l'immunosottenzione per l'imaging a fluorescenza, posizionare lo scivolo in una piastra di Petri di vetro contenente PBS e rimuovere con cura lo scivolo di copertura. Quindi lavare le sezioni dallo scivolo utilizzando delicati impulsi di PBS da una pipetta Pasteur. Posizionare le sezioni in una fiala di vetro pulita contenente PBS.
Eseguire la reazione HRP di Avidin incubando prima le sezioni nel complesso di biotina di Avidin o ABC, per almeno due ore per amplificare il prodotto di reazione HRP. Quindi, lavare le sezioni con PBS 3 volte per 10 minuti, quindi con tris buffer due volte per 10 minuti. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio tampone tris, aggiungere rapidamente una goccia di soluzione di cloruro di nichel all'otto per cento alla soluzione di diaminobenzidina o soluzione DAB.
Quindi pipettare la soluzione in uscita per mescolare e aggiungere rapidamente un millilitro di questa soluzione sulle sezioni. Incubare le sezioni in questa soluzione per 15 minuti. Quindi aggiungere 10 microlitri di perossido di idrogeno all'1% alla soluzione DAB.
Lasciare che la reazione proceda al buio sotto agitazione costante per circa uno o due minuti fino a quando le cellule non sono etichettate. In una cappa aspirante, posizionare un piccolo cerchio di carta da filtro in una piastra di Petri e smorzarlo con PB. Sollevare le sezioni una alla volta dal flaconcino di vetro utilizzando un pennello e posizionarle con cura piatte sulla carta. Coprire le sezioni con un altro cerchio inumidito di carta da filtro e rimuovere il tampone in eccesso toccando delicatamente la carta velina in superficie.
Applicare otto o nove gocce di tetrossido di osmio dell'uno per cento in PB sulla carta superiore. Coprire il piatto e conservare nel cappuccio dei fumi per almeno 30 minuti, ma non più di 1 ora. Dopo aver risciacquato, montato e copreto le sezioni, disidratare attraverso una serie di soluzioni al 50%, 70%, 95% e 100% di alcol.
Dopo la fase di disidratazione, trasferire le sezioni in una fiala di vetro contenente etanolo al 100% su uno shaker per circa cinque minuti. Sostituire la soluzione alcolica con ossido di propilene e lavare tre volte per cinque minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, tenere circa due millilitri di ossido di propilene nel flaconcino e aggiungere resina a un rapporto 1:1.
Assicurarsi che la resina sia sciolta e mantenere le sezioni sotto agitazione costante per 30 minuti. Dopo 30 minuti, utilizzare un bastoncino di legno per posizionare ogni sezione in una planchetta di alluminio contenente resina epossidica e incubare durante la notte. Il giorno successivo, posizionare la planchette su una piastra calda per circa 10 minuti.
Quindi raccogliere ogni sezione con un bastone di legno e posizionare su uno scivolo pulito. Una volta che tutte le sezioni sono state trasferite sulla diapositiva, visualizzare la diapositiva sotto un microscopio sezionante per controllare l'orientamento delle sezioni e posizionare un coverslip sulle sezioni. Curare in forno per 48 ore a 56 gradi Celsius.
Usa un obiettivo di ingrandimento basso per concentrarti sulla sezione home contenente il corpo cellulare. Quindi usa un obiettivo 100x, concentrati sul corpo della cella e fai clic al centro per contrassegnare il punto di riferimento. Per tracciare il soma in 3D usando l'obiettivo 100x, selezionare il contorno dalla scheda traccia e selezionare il contorno del corpo della cella.
Usa il joystick per spostare la messa a fuoco nella parte superiore del corpo cellulare. Posizionare i punti facendo clic sul perimetro della parte attualmente a fuoco. Fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate Chiudi contorno (Close Contour) per completare questo primo contorno.
Ripetere questo processo in diverse posizioni z fino a raggiungere la parte inferiore del corpo cellulare. Per rintracciare l'arbor dendritico, selezionare dendrite o dendrite apicale, nel menu neuronale. In primo luogo, tracciate un breve segmento iniziale per ogni dendrite utilizzando la rotellina di scorrimento del mouse per regolare il diametro del cursore in modo che corrisponda al diametro della dendrite.
Traccia lungo ogni dendrite. Quando viene raggiunto un nodo nell'albero, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere nodo biforcazione o nodo di triforcazione dal menu a discesa. Per identificare i punti corrispondenti tra i dendriti in una sezione che corrispondono alla sezione completata, fare clic sulla scheda Sposta e selezionare i punti di corrispondenza.
Selezionare il numero di punti da abbinare e quindi premere OK. Fare clic sulla fine di un ramo completato e quindi fare clic sul ramo. Ripetere questa situazione per ogni punto di corrispondenza. Una volta tracciati tutti i dendriti di ogni sezione, tracciare l'assone usando lo stesso processo Mostra qui una ricostruzione di una cella cestello CA2 con pergolato dendritico e assonale limitato utilizzando un tubo di disegno.
I dendriti sono in nero e l'assone è in rosso. Questa è un'immagine di esempio della cellula del cestello riempita di biocitina seguendo il protocollo HRP di Avidin descritto qui. Ecco un video di una ricostruzione neuronale 3D della cellula cesto CA2.
I dendriti sono in rosa scuro e l'assone è in bianco. Infine, questa immagine mostra un dendrogramma della cella del cestello CA2. Ci sarà bisogno di tempo per diventare abili con questo protocollo.
Tuttavia, questo approccio ottimizzato può generare immagini ad alta risoluzione di strutture corticali e ippocampali complesse in vitro.
