Le giunzioni gap sono state suggerite come obiettivi farmacologici. Il test Iodide-YFP-GJIC è compatibile con lo screening ad alta produttività per scoprire modulatori di giunzione gap. È stato utilizzato per testare gli effetti di un gran numero di composti sulle attività di giunzione gap in un periodo relativamente breve.
Il test Iodide-YFP-GJIC è semplice, robusto, ripetibile ed economico. Questo saggio richiede solo cellule accettori e donatrici e due soluzioni di sale bilanciate. Non sono necessari reagenti aggiuntivi come Lucifero giallo e Calcein AM.
Inoltre misura le attività totali di giunzione gap delle cellule in un unico pozzo, il che si traduce in una bassa variabilità tra i pozzi. Per iniziare questa procedura far crescere le celle LN215 all'80% di confluenza in DMEM integrato come descritto nel protocollo di testo. Un giorno prima della trasduzione lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS.
Aggiungere due millilitri dello 0,25% di EDTA di tripside alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, le cellule vengono rimorsi in cinque millilitri di mezzo di coltura e si regola la densità cellulare a 50.000 cellule per millilitro. Aggiungere 400 microlitri di supporti che contengono 20.000 celle a ciascun pozzo di una piastra di coltura di 24 pozzi.
Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo trasdurre due pozzi sostituendo il mezzo di coltura con 400 microlitri di una miscela uno-a-uno di un lentivirus e di un mezzo di coltura fresco integrato con polibrene ad una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro. Per i controlli no virus sostituire il mezzo di coltura con un mezzo di coltura fresco integrato con polibrene ad una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro.
Incubare a 37 gradi Celsius per 15 ore. Quindi aspirare il mezzo contenente lentivirus e mezzo di coltura fresco. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altre 72 ore.
Dopo questo, lavare le cellule in ogni pozzo due volte con 0,5 millilitri di PBS. Aggiungere 300 microlitri dello 0,25% di EDTA di tripsidenza alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Rimostrare le cellule in due millilitri di mezzo di coltura, quindi placcarle in piastre di coltura a sei pozzi con due microgrammi per millilitro di puromicina.
Coltura delle cellule fino a quando tutte le cellule nei pozzi di controllo sono morte, il che di solito richiede circa una settimana. In primo luogo, coltura separata cellule LN215-YFP e LN215-ioduro in piastre da 100 millimetri in mezzo di coltura per raggiungere le popolazioni necessarie per il saggio. Un giorno prima del test, lavare ogni piatto con 10 millilitri di PBS.
Trattare ogni piastra con due millilitri di soluzione EDTA allo 0,25% di tripside e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Resostipendare le cellule in quattro millilitri di mezzo di coltura e trasferirle in un tubi conici da 15 millilitri. Centrifuga a 1.000 g per tre minuti per pellettare le cellule.
Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di coltura. Pipetta su e giù circa 20 volte per rompere eventuali grumi cellulari. Usa un emocitometro per contare le cellule.
E poi diluire le cellule nel mezzo di coltura per fare la sospensione cellulare alle densità mostrate qui. Quindi, mescolare sette millilitri di ogni sospensione cellulare insieme in un serbatoio. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di questa miscela a ciascun pozzo di una piastra di coltura da 96 porri.
Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 24 ore. In primo luogo, utilizzare un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 20X e un filtro GFP per controllare le piastre a 96 po 'per essere sicuri che non ci siano grumi di cellule e che le colture siano completamente confluenti e ben distribuite. Almeno 30 minuti prima del test accendere un lettore di micropiatte e impostarlo a 37 gradi Celsius.
Lavare il tubo di un iniettore automatizzato con tre millilitri di etanolo al 70%, tre millilitri di acqua distillata e tre millilitri di soluzione I. Quindi, riscaldare le soluzioni C e I a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Aspirare il mezzo di crescita o invertire la piastra per svuotarla.
Toccare qualsiasi mezzo residuo. Quindi aggiungere la soluzione C a un serbatoio utilizzando una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri di soluzione C a ciascun pozzo della piastra. Aspirare la soluzione o invertire la piastra per svuotarla, facendo toccare qualsiasi soluzione residua.
Aggiungere 50 microlitri di soluzione C ad ogni pozzo. Quindi aggiungere un microlitri di uno stock chimico da 2,5 millimolare o DMSO come veicolo e aggiungere altri 50 microlitri di soluzione C a ciascun pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'aria per circa 10 minuti.
Durante l'incubazione, iniziare a impostare i parametri nel programma di lettura delle micropiatte facendo clic sul pulsante Gestisci protocolli. Fare clic sul pulsante Nuovo. Selezionate intensità fluorescenza nella sezione Metodo di misura e Modalità pozzo nella sezione Modalità di lettura.
Fare quindi clic sul pulsante OK. Verrà visualizzata una nuova scheda. Nel menu Parametri di base impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 485 nanometri e l'emissione a 520 nanometri.
Selezionare l'ottica inferiore per leggere la fluorescenza dal basso. Quindi impostare l'ora di inizio della misurazione su zero secondi, il numero di intervalli su 25, il numero di lampi per pozzo e intervallo su 20 e il tempo di intervallo su 0,4 secondi. Nel menu Layout disegnare un'area della piastra da leggere.
Nel menu Concentrazioni/Volumi/Shacking impostare il lettore di micropiatte per iniettare 100 microlitri di soluzione I a ciascun pozzo con una velocità di iniezione di 135 microlitri al secondo. Nel menu Tempo di iniezione impostare l'ora di inizio dell'iniezione su un secondo. Quindi fare clic sul pulsante Avvia misurazione.
Al termine dell'incubazione, trasferire le piastre da 96 pozzi al lettore di micropiatte e avviare nuovamente la misurazione facendo clic sul pulsante Avvia misurazione. In questo studio, il saggio di comunicazione intercellulare proteina fluorescente giallo-iodio viene utilizzato con le cellule LN215-YFP e LN215-iodio per migliorare le sostanze chimiche 2.320 per identificare nuovi modulatori di comunicazione intracellulare a giunzione gap. Si vede che l'omosalato inibisce il 50% della comunicazione intracellulare di giunzione gap.
Mentre la terbinafina lo inibisce completamente. Questo conferma la terbinafina come inibitore della giunzione gap. Questo saggio misura il GJIC tra le cellule vicine del donatore e dell'accettore, quindi le cellule del donatore e dell'accettore devono essere completamente dissociate prima della placcatura.
E la confluenza della coltura mista dovrebbe essere del 100% per massimizzare la formazione di giunzioni di gap tra le cellule. I dati del corso del tempo, le relazioni di risposta alla dose e la valutazione della reversibilità dei modulatori di giunzione gap possono essere ottenuti con il saggio Iodide-YFP-GJIC. Inoltre, i test GJIC specifici della connessione Iodide-YFP possono essere stabiliti inducendo l'espressione di una connexina di interesse nelle cellule prive di giunzioni funzionali gap.
Ciò consente di determinare il valore IC50 di una sostanza chimica di un tipo specifico di connexina. Il test Iodide-YFP-GJIC può essere utilizzato per lo screening ad alta produttività, perché è robusto, ripetibile ed economico. Questo test aiuta a trovare la giunzione gap che modula le sostanze chimiche per la scoperta di farmaci e la valutazione tossicologica.
