Questo metodo consente una quantificazione precisa degli istoni del nucleo H3 e H4 e delle loro modifiche post-tras traslazione da estratti cellulari e tissutali, portando di conseguenza alla generazione di risultati riproducibili e di alta qualità. La tecnica presentata presenta tre vantaggi principali. In primo luogo, conserva le modifiche post-traslazionali native degli istoni.
In secondo luogo, ignora costosi metodi a bassa produttività. Infine, è completamente compatibile con le applicazioni a media velocità effettiva downstream. A dimostrare la procedura sarà Karolina Janczura, una talentuosa studentessa laureata del mio laboratorio che ha ottimizzato completamente questo protocollo e ha utilizzato la tecnica per rispondere a importanti domande riguardanti la regolazione epigenetica nel morbo di Alzheimer.
Per iniziare a placcare le cellule in piatti trattati con coltura tissutale di 10 centimetri con i mezzi di coltura cellulare appropriati secondo il protocollo di testo. Consentire alle celle di crescere fino a raggiungere circa il 90% di confluenza. Dopo che le cellule hanno raggiunto la confluenza desiderata, aspirare delicatamente il supporto di coltura e lavare le cellule due volte con mezzi senza siero prebellici.
Successivamente, rimuovere il supporto privo di siero dalle cellule e posizionare i piatti di 10 centimetri sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di tampone di estrazione ghiacciato ad ogni piatto. Utilizzando un raschietto per celle di plastica raccogliere le cellule nel tampone di estrazione e trasferirle in un tubo etichettato da 1,5 millilitri.
Quindi posizionare i tubi sul ghiaccio. Se viene utilizzato tessuto congelato, posizionare il tessuto in un tubo pre-refrigerato da 1,5 millilitri e scongelarlo brevemente sul ghiaccio. Successivamente omogeneizzare il tessuto cerebrale con un omogeneizzatore portatile utilizzando la quantità raccomandata di tampone di estrazione e il numero di ictus.
L'omogeneizzazione è completa quando non ci sono frammenti di tessuto visibili e la soluzione assume un aspetto lattinoso. Successivamente, utilizzare una pipetta a canale singolo da 1.000 microlitri per trasferire l'omogeneato in un tubo pre-refrigerato da 1,5 millilitri e posizionare i tubi sul ghiaccio. Posizionare il tubo contenente i lisati cellulari e il tessuto cerebrale omogeneizzato su una piattaforma rotante che ruota a 15 RPM a quattro gradi Celsius.
Successivamente, centrifuga il tubo alla massima velocità per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente trasferire il supernatante in un nuovo tubo pre-refrigerato da 1,5 millilitri e scartare il pellet. Successivamente neutralizzare gli istoni con un volume 1/4 di buffer di neutralizzazione e mescolare pipettando su e giù.
Utilizzare strisce di pH per controllare il pH della miscela e, se necessario, regolare ulteriormente il pH con tampone di neutralizzazione. Se gli istoni acidi non vengono neutralizzati durante questo passaggio, non si legano correttamente alla membrana della colonna, lo attraversano e verranno rilevati nel flusso. Aggiungere 37,5 microlitri del campione a 12,5 microlitri di tampone campione.
Dopo una breve densità di centrifugazione la miscela a 99 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, posizionare i tubi sul ghiaccio e girarli brevemente per raccogliere la condensa. Caricare il campione su un gel SDS-PAGE ed eseguire il gel a 100 volt per un'ora.
Quindi macchiare il gel durante la notte. E trattenerlo durante tre lavaggi consecutivi. Aggiungere innanzitutto 500 microlitri di buffer di equilibrazione a ciascuna colonna di spin.
Centrifuga la colonna per tre minuti. Scartare ancora una volta il flusso e ripetere la centrifugazione. Successivamente aggiungere 500 microlitri del campione alla colonna.
Centrifugare la colonna per tre minuti e raccogliere il flusso. Quindi analizzare il flusso della colonna come descritto in precedenza. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio alla colonna.
Centrifugare la colonna per tre minuti e raccogliere il flusso. Trasferire la colonna in un nuovo tubo etichettato da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 microlitri del buffer di eluizione dell'istone alla colonna.
Dopo aver centrifugato la colonna salvare il flusso-through contenente proteine istono. Sotto una cappa chimica aggiungere acido perclorico agli istoni purificati per ottenere una concentrazione finale del 4% di acido perclorico. Pipetta su e giù sei volte per mescolare.
Se gli istoni nel campione sono molto concentrati, la soluzione diventerà torbosa dopo l'aggiunta di acido perclorico. Dopo questo, incubare il tubo a quattro gradi Celsius per 24 ore. Se la precipitazione istonale durante la notte ha successo, un piccolo pellet bianco sarà visibile sul fondo del flaconcino dopo la fase di centrifugazione.
Quando si lava il pellet nei passaggi consecutivi assicurarsi che il pellet non sia disturbato in quanto può facilmente staccarsi dal fondo del flaconcino. Il giorno dopo centrifugare i campioni per 75 minuti in tubi di microcentrifugo pre-refrigerati. Aspirare con cura il supernatante e aggiungere 500 microlitri di acido perclorico ghiacciato-freddo al campione pelletato.
Dopo aver centrifugato il campione per 10 minuti alla massima velocità, aspirare il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di acetone ghiacciato al campione facendo attenzione a non disturbare il pellet. Quindi rimuovere il supernatante e lasciare asciugare i tubi non con la punta sul ghiaccio per 30 minuti.
Quindi rimuovere i tubi dal ghiaccio e lasciare asciugare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo che il pellet è stato asciutto, riprenodirlo in 30 microlitri di acqua sterile. Limitare i tubi e lasciare ricostituire gli istoni sul ghiaccio per 30-50 minuti.
Dopo aver verificato che il pellet sia rimorsipenso, riacquisito i tubi e rimuoverli dal ghiaccio. In questo protocollo gli istoni delle cellule umane microgliali BV-2 sono stati purificati e la composizione dell'estratto è stata analizzata. Il gel colorato dimostra che i tempi di estrazione tra i 15 minuti e le 24 ore non hanno influito sulla composizione complessiva degli estratti di istone grezzi.
L'efficienza del legame istono alla matrice della colonna è stata analizzata mediante colorazione del gel. L'efficienza delle colonne era di circa il 100%, come evidenziato dall'assenza di proteine istono rilevabili nel flusso della colonna. Indipendentemente dalla durata del tempo di estrazione, cioè
15 minuti, due ore o 24 ore. il lavaggio della prima colonna elimina la maggiore quantità di proteine non istone dall'estratto. Le frazioni di proteina istono purificate del gruppo di estrazione di 24 ore contenevano più istoni H3 e H4 rispetto ai tempi di estrazione di 15 minuti e due ore.
L'eluizione della prima colonna era efficiente al 100% circa, come evidenziato dalla mancanza di proteine istono nel secondo eluato. Gli istoni grezzi sono stati poi estratti da tutto il cervello del topo e sono state misurate modifiche post-tras traslizionali. In risposta all'inibitore HADC ad ampia azione, tributirina, l'acetilazione H4K12 è aumentata nell'estratto.
Tuttavia, la specificità dell'anticorpo è diminuita a causa della presenza di impurità nell'estratto grezzo. Il protocollo di purificazione dell'istone è stato completato con la corteccia prefrontale di topi A/D transgenici tripli trattati con l'inibitore HDAC di classe I e IIb, M344, e la singola frazione istonale del nucleo puro è stata valutata per i cambiamenti nell'acetilazione H4K12. Sono stati rilevati istoni totali ed è stato osservato un aumento significativo dell'acetilazione H4K12 in risposta all'M344.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di eseguire i più checkpoint descritti all'interno del protocollo per convalidare la corretta purificazione dell'istono durante tutto il processo. Seguendo questa procedura, è possibile affrontare ulteriori domande riguardanti la fosforilazione istono e lo stato di metilazione. Lo sviluppo di questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori del nostro laboratorio per analizzare i meccanismi genetici coinvolti nel morbo di Alzheimer.
Tuttavia può essere utilizzato in una varietà di modelli di malattia in cui si ipotizza che la modificazione della cromatina svolga un ruolo significativo.
