Gli autori desiderano ringraziare il Institutional Animal Care HealthPartners e utilizzo Comitato all&#39;ospedale regioni.

1. L&#39;acclimatazione di Gestione per somministrazione endonasale di Mice Awake Introduzione Topi devono essere acclimatati per gestire per un periodo di 2-4 settimane prima dell&#39;inizio della somministrazione endonasale. L&#39;acclimatazione al trattamento è importante, in quanto aiuta a garantire una posizione corretta del corpo per la massima efficacia della somministrazione di farmaci intranasale sveglio. Inoltre, i topi che non sono stati adeguatamente abituati a questo processo può avere una reazione grave ansia dopo la somministrazione. I topi dovrebbe spendere circa 2-3 giorni in ciascuno dei nove passi prima di passare alla fase successiva, a seconda della comodità dell&#39;animale alla movimentazione. Livello di stress del mouse deve essere utilizzato come misura del progresso. Ciò significa che il controllo dei movimenti del topo, la quantità / frequenza della minzione, defecazione, tremante, e mordere. Se il mouse è dotato di una risposta di elevato stress, rimanere su quel passo prima di passare a quello successivo fino a quando la risposta si riduce. Un campione acclimatazione schedule si può vedere nella tabella 1. Acclimatazione dei topi dovrebbe progredire attraverso i seguenti volta al giorno passi. Eseguire le operazioni descritte più di una volta al giorno, nel tentativo di accelerare l&#39;acclimatazione, non è raccomandato. <ol><li> Posizionare il mouse nel palmo della mano per un periodo di 2-3 minuti, non più di un piede sopra la parte superiore della gabbia, come animali frequentemente saltate durante questa fase introduttiva. Se il mouse tenta di strisciare fuori dalla mano e il proprio braccio, basta sollevare il mouse dalla base della coda e rimetterlo in mano. </li><li> Posizionare il mouse nel palmo della mano per tre minuti e pet l&#39;animale delicatamente. Pet il mouse direzionale dalla testa alla coda, permettendo all&#39;animale di muoversi liberamente. </li><li> Posizionare il mouse nel palmo della mano per tre minuti mentre massaggia dietro le orecchie (leggermente pizzicare insieme la pelle sulla parte posteriore del collo con il pollice e il dito indice). </li><li> Tenere / lift il mouse dalla collottola per 30 sec, lasciando il resto del mouse sulla parte superiore della gabbia per 30 secondi prima di ripetere la presa di nuovo. </li><li> Tenere il mouse utilizzando il grip intranasale, che è descritta nella sezione 2, ma non invertire l&#39;animale (completare fino al punto 2.4). Tenere l&#39;animale in questo modo per un periodo di 30 secondi e rilasciare torna gabbia. Ripetere una seconda volta dopo un periodo di un minuto di riposo. </li><li> Tenere il mouse con la presa intranasale, come descritto nella sezione 2, tra cui invertendo l&#39;animale per cui il suo lato ventrale è rivolto verso l&#39;alto verso il soffitto. Assicurarsi che il collo dell&#39;animale è parallelo al pavimento. Mantenere questa posizione per 30 secondi. Ripetere questa operazione una seconda volta dopo un periodo di un minuto di riposo. Alcuni topi resistere alla presa intranasale più di altri, in particolare quando viene utilizzato per la prima volta con inversione in questa fase nella acclimatazione. Se il mouse si libera dalla morsa, mettere il mouse indietro sulla parte superiore della gabbia e ri-presa. Ripetere la ri-presa se necessario, Ma monitorare il livello di stress del mouse e riportarlo alla gabbia, se necessario. Un altro fattore che può giocare un ruolo nel perdere l&#39;aderenza a questo punto il processo di acclimatazione è inesperienza dei gestori di animali con la tecnica di somministrazione intranasale. </li><li> Tenere il mouse con la presa intranasale, invertire, brevemente mettere una pipetta con una punta vuoto su ogni narice, e tenere la posizione degli animali per 30 sec. Ripetere questo dopo un minuto di riposo. </li><li> Tenere il mouse con il grip intranasale, è invertito, e intranasale amministrare 6 ml di soluzione fisiologica nel nare a destra ea sinistra, come descritto nella sezione 3 (fino al passo 3.7). </li><li> Tenere il mouse con la presa intranasale, invertito, e intranasale amministrare 6 ml di soluzione fisiologica nel nare a destra ea sinistra due volte ponendo l&#39;animale indietro sulla parte superiore della gabbia in mezzo, come descritto nella sezione 3. </li></ol> 2. Il Grip intranasale a Immobilizzare Mice Awake <ol><li> Posizionare l&#39;O del mousen la gabbia superiore. </li><li> Con il pollice e l&#39;indice della mano dominante, tenere premuto il mouse per la coda. Utilizzando il medio, anulare e mignoli, leggermente pin la porzione inferiore del corpo all&#39;inizio gabbia (Figura 1A). Lasciate che il topo afferrare le sbarre, come si allungare leggermente il mouse fuori e meglio prendere la collottola. </li><li> Con il pollice e il medio sul vostro mano non dominante, stringere il mouse saldamente la collottola (eccesso di pelle) dietro il collo e le spalle. Sollevare la pelle flaccida di fare una tenda di pelle tra le scapole (Figura 1B). Prendere la pelle il più possibile, ma attenzione a non tirare il muscolo in quanto ciò causare disagio al mouse. Prestare attenzione al fine di non applicare troppa pressione alla cassa toracica dell&#39;animale o della colonna vertebrale. Pressione eccessiva o tirando la pelle può portare all&#39;inibizione della respirazione in alcuni casi. </li><li> Rapidamente posizionare il dito indice della mano non dominante sulla testa del mouse comevicino al naso possibile e tirare la pelle (Figura 1C, 1D). Allo stesso tempo, far scorrere il pollice e il dito medio verso la testa per la posizione ottimale. Idealmente, il mouse non dovrebbe essere in grado di muovere la testa in verticale o in orizzontale. </li><li> Pur mantenendo la presa sulla collottola, girare il mouse sulla schiena. Indietro Il mouse dovrebbe essere nel palmo della vostra mano. Tenere saldamente la coda del topo (vicino alla base) contro il palmo della mano con le ultime due dita (anulare e mignolo) per stabilizzare il mouse, oppure si può avvolgere le dita attraverso la parte inferiore del corpo (Figura 1E, 1F). </li><li> A questo punto assicurarsi che il collo del topo e del mento sono piane e parallele al pavimento. Il mento deve essere vicino a un angolo di 180 gradi con il collo, per quanto possibile per aiutare con la somministrazione intranasale. Lievi variazioni dell&#39;angolo può causare la droga a finire nel sito sbagliato. Assicurarsi che il mouse è in grado di respirare guardando l&#39;addome. Il mouse should non essere in grado di muoversi, ma deve essere confortevole e non in alcun dolore. Se si vede il collo del mouse e il mento facendo una &quot;V&quot;, allora avete bisogno di ri-presa. </li></ol> 3. Consegna intranasale di droga per topi Awake Introduzione Utilizzando l&#39;impugnatura intranasale, ciascun topo è trattenuto due volte e tenuto con il collo parallelo al pavimento, mentre un volume di 20-30 ml di liquido viene somministrato. Questo volume è sicuro ed efficace per le piccole-grandi topi, si utilizzano in genere 24 microlitri, e che è descritto in questo protocollo. Il metodo sveglio intranasale può essere utilizzato in topi di qualsiasi età, per esempio in topi neonati per la ricerca evolutiva neuroscienze. In topi neonati, un volume totale inferiore (8 pl) e dimensione delle gocce (1 ml) deve essere utilizzato per accogliere il volume più piccolo della cavità nasale. Droga è in genere consegnato a due mouse alla volta, alternando periodi di riposo di fare un uso più efficiente del tempo e mantenere on programma. Set-up sarà un po &#39;diverso a seconda se si sta dosaggio topi del gruppo ospitato o topi alloggiati individualmente. Con i topi tenuti in ricoveri individuali, è utile inserire tutti i materiali tra le gabbie per evitare che i topi da attraversare alla cima gabbia altro. Con il gruppo-alloggiato i topi, la dose da quella gabbia solo. È importante che ciascun topo in gabbia alloggiato in gruppo riceve lo stesso trattamento intranasale, come potenziale di contaminazione incrociata dei due diversi trattamenti esiste grazie alla espulsione farmaco in aria o con contatto cutaneo. E &#39;altamente raccomandato che un foglio di dosaggio da stampare in anticipo, per ricordare i tecnici di incarichi di trattamento, di registrare le note delle gocce perse, da notare la salute generale di ciascun animale, ecc Passi <ol><li> Impostare gabbie dove dovrebbero essere per il dosaggio, e impostare una stazione di dosaggio (Figura 2). </li><li> Rimuovere mouse dalla gabbia e mantenere in cima gabbia durante il dosaggio. </li><li> Prendete il mouse utilizzando il grip intranasale descritto nella sezione 2. </li><li> Con la mano dominante, caricare la pipetta con 6 ml di farmaco o di un veicolo. Posizionare la punta della pipetta riempita vicino narice sinistra del mouse, di solito in un angolo di 45 gradi (Figura 1G, 1H). Se si dispone di una soluzione viscosa, potrebbe essere necessario aumentare il vostro angolo di 90 gradi, perché il farmaco può essere eseguito sul lato della punta della pipetta, invece di fare una goccia. Se molto viscoso, asciugandosi la punta della pipetta con un panno prima di espellere liquido può aiutare. Lentamente espellere il farmaco per formare una gocciolina piccola con circa metà del volume (3 ml). </li><li> La goccia dovrebbe essere collocato sufficientemente vicino alla narice del mouse in modo che il mouse può inalare la goccia. Subito dopo il mouse inala questa piccola goccia, espellere il resto del farmaco nella punta della pipetta per formare un altro piccola goccia per il mouse per inalare attraverso la stessa narice circa 2-3 secondi più tardi. Assicuratevi di guardare la bocca. Se is qualsiasi liquido in bocca, la goccia non ce l&#39;ha fatta completamente nel naso e questo dovrebbe essere notato. </li><li> Tenete il mouse in questa posizione per 15 secondi. E &#39;altamente raccomandato che un timer da utilizzare per standardizzare questi 15 attesa sec. </li><li> Ripetere i passaggi 3,3-3,6 per la narice destra. Se le gocce sono sbuffò fuori, quella goccia dovrebbe essere sostituito e ha preso atto. </li><li> Posizionare il mouse di nuovo al top della sua gabbia per 2 min. Ripetere l&#39;intero processo di partenza 2 min. dopo la consegna della prima goccia. Questo dà il mouse quattro gocce di 6 microlitri ciascuna totale di 24 microlitri di soluzione. Un esempio di orario per il dosaggio di uno o due topi in una volta può essere visto in Tabella 2. </li><li> Dopo che il mouse ha ricevuto tutte le gocce, riportare il mouse per la sua gabbia. </li></ol> 4. Generali tecniche di gestione degli animali di acclimatazione e consegna intranasale del farmaco a topi Awake Dopo ogni sessione di acclimatazione o di somministrazione endonasale, topi dovrebbe essere darena trattare, ad esempio un Cheerio o girasole sfogliato come rinforzo positivo. Tratta sono dati come una ricompensa e per distrarli da graffi il naso, potrebbe causare lesioni a se stessi. Quando si lavora con i topi del gruppo ospitato, tratta abbastanza dovrebbe essere eliminato per ogni mouse. Prima di tornare al loro gabbie animali assicurarsi di ripristinare nidi allo stato originale, al fine di ridurre lo stress. Quando dosaggio gruppo animali alloggiati, guanti devono essere sostituiti tra dosaggio di gabbie per non trasferire profumo da colonia a colonia gabbia gabbia, in quanto sarà aggressivo verso l&#39;altra.

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	<li>Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system:+mechanisms+and+experimental+considerations.">Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations.</a> J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).</li><li>Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+insulin-like+growth+factor-I+to+the+rat+brain+and+spinal+cord+along+olfactory+and+trigeminal+pathways+following+intranasal+administration.">Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration.</a> Neuroscience. , 127-481 (2004).</li><li>Benedict, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+insulin+as+a+therapeutic+option+in+the+treatment+of+cognitive+impairments.">Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments.</a> Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).</li><li>Francis, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+insulin+prevents+cognitive+decline,+cerebral+atrophy+and+white+matter+changes+in+murine+type+I+diabetic+encephalopathy.">Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy.</a> Brain. 131, 3311-3334 (2008).</li><li>Francis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+insulin+ameliorates+experimental+diabetic+neuropathy.">Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy.</a> Diabetes. 58, 934-945 (2009).</li><li>Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Awake+intranasal+insulin+delivery+modifies+protein+complexes+and+alters+memory,+anxiety,+and+olfactory+behaviors.">Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors.</a> J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).</li><li>Hanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+deferoxamine+reduces+spatial+memory+loss+in+APP/PS1+mice.">Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice.</a> Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+intranasal+losartan+in+the+APP/PS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease.">Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease.</a> Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).</li><li>Fine, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+deferoxamine+improves+performance+in+radial+arm+water+maze,+stabilizes+HIF-1alpha,+and+phosphorylates+GSK3beta+in+P301L+tau+transgenic+mice.">Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice.</a> Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).</li><li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system.">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).</li><li>Hanson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+deferoxamine+provides+increased+brain+exposure+and+significant+protection+in+rat+ischemic+stroke.">Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke.</a> J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).</li><li>Reger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intranasal+insulin+on+cognition+in+memory-impaired+older+adults:+modulation+by+APOE+genotype.">Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype.</a> Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).</li><li>Kim, C. H., Song, H. y. u. n., M, E. u. n. A. h. n., Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypo-,+iso-+and+hypertonic+saline+irrigation+on+secretory+mucins+and+morphology+of+cultured+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells.</a> Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).</li><li>Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+increases+secretory+and+exudative+responsiveness+of+human+nasal+airway+in+vivo.">Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo.</a> Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo mostra come topi possono essere somministrate dosi regolari di farmaci intranasale di indirizzare il cervello senza l&#39;uso di anestesia. Farmaco intranasale può essere consegnato a grandi gruppi di topi per lunghi periodi di tempo con il minimo sforzo. Un singolo gruppo di 20 topi possono essere intranasale trattata da una sola persona in meno di un&#39;ora. Una vasta gamma di molecole, che vanno da chelanti del ferro piccoli fattori di crescita per le cellule staminali mesenchimali, sono stati dimostr...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Materials</td>
 <td>Company</td>
 <td>Cat #</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P20 pipettor set at 6 &mu;l</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading pipette tips</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waste receptacle for tips</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dosing sheet for notes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drug and vehicle</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Container to hold drug vials</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Animals to be dosed</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spare gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paper towels to wipe urine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Materials Needed</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

intranasal administration of cns therapeutics to awake mice

Somministrazione intranasale è un metodo di fornire agenti terapeutici per il sistema nervoso centrale (CNS). E non è invasivo e permette di molecole di grandi dimensioni che non attraversano il sangue-cervello barriera di accesso al sistema nervoso centrale. I farmaci sono direttamente mirate al sistema nervoso centrale, con la somministrazione intranasale, riducendo l&#39;esposizione sistemica e quindi indesiderati effetti collaterali sistemici 1. Consegna dal naso al SNC verifica in pochi minuti lungo entrambe le vie olfattive e trigemino neurali tramite via extracellulare e non richiede farmaco di legarsi al recettore o qualsiasi trasporto assonale 2. Consegna intranasale è un metodo ampiamente pubblicizzato ed è attualmente utilizzato nel corso degli studi clinici 3. Consegna intranasale dei farmaci in modelli animali permette per la valutazione iniziale di distribuzione farmacocinetica ed efficacia. Con i topi, è possibile somministrare farmaci per animali svegli (non anestetizzati) su base regolare utilizzando un spelizzati presa intranasale. Consegna Awake è utile perché permette di lungo periodo di somministrazione cronica senza anestesia, ci vuole meno tempo che con l&#39;anestesia, e può essere imparato e fatto da molte persone in modo che squadre di tecnici sono in grado numero grande dose di topi in brevi periodi. Efficacia di terapie somministrate intranasale in questo modo di topi è stata dimostrata in numerosi studi inclusi insulina in modelli murini diabetici 4-6 e deferoxamina in modelli di topo di Alzheimer. 7,8 L&#39;impugnatura intranasale per i topi possono essere apprese, ma non è facile e richiede pratica, abilità, e una presa precisa per fornire in modo efficace farmaco per il cervello ed evitare il drenaggio al polmone e dello stomaco. I topi sono trattenuti a mano usando un scruff modificato nella mano non dominante con il collo tenuto parallelo al pavimento, mentre il farmaco viene fornito con una pipetta con la mano dominante. Di solito ci vogliono 3-4 settimane di acclimatando al trattamento prima di topipuò essere tenuto con questa presa senza risposta allo stress. Abbiamo preparato il video JoVE per rendere questa tecnica di somministrazione intranasale più accessibile.

Esistono diversi modi per determinare l&#39;efficacia della somministrazione di farmaci. Il primo è quello di somministrare intranasale un colorante, come inchiostro India o blu di metilene e di visualizzare il colorante dopo eutanasia dell&#39;animale nel epitelio olfattivo e dopo il cervello è rimosso, entrando dal SNC attraverso la lamina cribrosa. Il secondo è quello di misurare il farmaco somministrato mediante utilizzo di un tag radio-marcato o ELISA utilizzando il rilevamento della molecola non marcato. Un buo...

Watch this Scientific Journal Video about Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice at JoVE.com

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Un metodo per somministrare farmaci per via intranasale topi svegli per lo scopo di indirizzare il cervello è descritto. Questo metodo consente di ripetere il dosaggio per lunghi periodi con la somministrazione intranasale del farmaco senza anestesia, e faccia a cervello di consegna con un&#39;esposizione sistemica minima.

Somministrazione intranasale di terapeutica del sistema nervoso centrale di topi Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

intranasal-administration-of-cns-therapeutics-to-awake-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

58.5K Views.  HealthPartners Institute for Education and Research. Un metodo per somministrare farmaci per via intranasale topi svegli per lo scopo di indirizzare il cervello è descritto. Questo metodo consente di ripetere il dosaggio per lunghi periodi con la somministrazione intranasale del farmaco senza anestesia, e faccia a cervello di consegna con un'esposizione sistemica minima.

Video: Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modello Rat di emato-encefalica Turbativa Barriera per consentire mirato Therapeutics neurovascolare

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

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Medicina

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusi carotide di farmacocinetica e di farmacodinamica Analisi dei taxani nei topi

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Valutazione non invasiva della efficacia di nuove terapie per patologie intestinali Utilizzando Serial Imaging endoscopica Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

A Hydrogel Construct and Fibrin-based Glue Approach to Deliver Therapeutics in a Murine Myocardial Infarction Model.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo1. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased. 
Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream5. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

Un idrogel Costruire e fibrina-based Glue approccio per fornire Therapeutics in una murino Myocardial Infarction Model.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

Un ratto carotidea Pallone Lesioni modello per verificare Therapeutics ritocca Anti-vascolari

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing factor in the overall outcome. Immunoblotting, flow cytometry and fixed cell experiments are often used to study how cells respond to anti-cancer drugs. These methods are important, but they have several shortcomings. Variability in drug responses between cancer and normal cells, and between cells of different cancer origin, and transient and rare responses are difficult to understand using population averaging assays and without being able to directly track and analyze them longitudinally. The microscope is particularly well suited to image live cells. Advancements in technology enable us to routinely image cells at a resolution that enables not only cell tracking, but also the observation of a variety of cellular responses. We describe an approach in detail that allows for the continuous time-lapse imaging of cells during the drug response for essentially as long as desired, typically up to 96 hr. Using variations of the approach, cells can be monitored for weeks. With the employment of genetically encoded fluorescent biosensors numerous processes, pathways and responses can be followed. We show examples that include tracking and quantification of cell growth and cell cycle progression, chromosome dynamics, DNA damage, and cell death. We also discuss variations of the technique and its flexibility, and highlight some common pitfalls.

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del Cerebrovasculature: Rilevanza per le malattie del sistema nervoso centrale

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Novel Methods for Intranasal Administration Under Inhalation Anesthesia to Evaluate Nose-to-Brain Drug Delivery

Intranasal administration has been reported to be a potential pathway for nose-to-brain delivery of therapeutic agents that circumvents the blood-brain barrier. However, there have been few reports regarding not only the quantitative analysis but also optimal administration conditions and dosing regimens for investigations of nose-to-brain delivery. The limited progress in research on nose-to-brain pathway mechanisms using rodents represents a significant impediment in terms of designing nose-to-brain delivery systems for candidate drugs.
To gain some headway in this regard, we developed and evaluated two novel methods of stable intranasal administration under inhalation anesthesia for experimental animals. We also describe a method for the evaluation of drug distribution levels in the brain via the nose-to-brain pathway using radio-labeled [14C]-inulin (molecular weight: 5,000) as a model substrate of water-soluble macromolecules.
Initially, we developed a pipette-based intranasal administration protocol using temporarily openable masks, which enabled us to perform reliable administration to animals under stable anesthesia. Using this system, [14C]-inulin could be delivered to the brain with little experimental error.
We subsequently developed an intranasal administration protocol entailing reverse cannulation from the airway side through the esophagus, which was developed to minimize the effects of mucociliary clearance (MC). This technique led to significantly higher levels of [14C]-inulin, which was quantitatively detected in the olfactory bulb, cerebrum, and medulla oblongata, than the pipette method. This appears to be because retention of the drug solution in the nasal cavity was substantially increased by active administration using a syringe pump in a direction opposite to the MC into the nasal cavity.
In conclusion, the two methods of intranasal administration developed in this study can be expected to be extremely useful techniques for evaluating pharmacokinetics in rodents. The reverse cannulation method, in particular, could be useful for evaluating the full potential of nose-to-brain delivery of drug candidates.

Here, we describe two novel methods of stable intranasal administration under inhalation anesthesia with minimal physical stress for experimental animals. We also describe a method for quantitative evaluation of drug distribution levels in the brain via the nose-to-brain pathway using radiolabeled [14C]-inulin as a model substrate of water-soluble macromolecules.

Metodi innovativi per la somministrazione intranasale in anestesia per inalazione per valutare il naso--cervello Drug Delivery

Intranasal administration has been reported to be a potential pathway for nose-to-brain delivery of therapeutic agents that circumvents the blood-brain ...

Somministrazione intranasale di terapeutica del sistema nervoso centrale di topi Awake

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