Il protocollo presenta un metodo di facile esecuzione per la coltivazione di biofilm cross-kingdom costituiti da StreptococcuS. mutans e Candida albicans. La successiva ratiometria del pH a base di microscopia confocale consente un monitoraggio accurato degli sviluppi del pH all'interno della matrice extracellulare di tali biofilm.
L'attenta scelta dei parametri di acquisizione delle immagini è della massima importanza per ottenere dati di immagine con un contrasto sufficiente per l'analisi successiva. La ratiometria del pH è un metodo rapido, preciso ed economico per studiare sia i gradienti di pH orizzontali che verticali nei biofilm cross-kingdom in tempo reale. La ratiometria del pH può anche essere eseguita in biofilm puramente fungini e batterici.
Il metodo contribuisce ad aumentare la nostra comprensione del metabolismo microbico nei biofilm. A dimostrare la procedura per la crescita del biofilm sarà Anette Aakjaer Thomsen, un tecnico del mio laboratorio. Coltivare S.mutans e C.albicans su piastre di agar del sangue a 37 gradi Celsius in condizioni aerobiche.
Quindi trasferire singole colonie di ogni organismo in provette piene di cinque millilitri di infusione di cuore cerebrale e farle crescere per altre 18 ore. Il giorno dopo, centrifuga le colture a 1.200 volte g per cinque minuti e scarta il supernatante. Rimescolare le cellule in soluzione salina fisiologica e regolare l'OD 550 a 0,5 sia per i C.albicans che per gli S.mutans.
Quindi diluire la sospensione S.mutans da uno a 10 per ottenere concentrazioni equivalenti. Pipetta 50 microlitri di soluzione salivare sterile nei pozzi di una piastra ottica bottom da 96 porri per microscopia. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi lavare la piastra tre volte con 100 microlitri di soluzione salina fisiologica sterile e svuotare i pozzi.
Aggiungere 100 microlitri di sospensione C.albicans ad ogni pozzo, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 90 minuti, quindi lavare il pozzo tre volte con soluzione salina. Aggiungere quindi 100 microlitri di siero bovino fetale inattivato termicamente ad ogni pozzo. Incubare il piatto per due ore, quindi lavarlo tre volte con soluzione salina.
Svuotare i pozzi ma lasciare un serbatoio da 20 microliter per evitare eccessive forze di taglio. Aggiungere 100 microlitri di sospensione S.mutans e 150 microlitri di BHI con il 5% di saccarosio ad ogni pozzo. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore o più.
Quando si coltivano biofilm più vecchi, sostituire il mezzo ogni giorno. Al termine della fase di crescita cross-kingdom, lavare il piatto cinque volte con soluzione salina fisiologica sterile. Per l'imaging pH ratiometrico, utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertito con una lente ad immersione in olio o acqua 63X, una linea laser da 543 nanometri e un sistema di imaging spettrale.
Utilizzare un incubatore per riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi Celsius. Impostare il rilevatore per il rilevamento simultaneo della fluorescenza verde da 576 a 608 nanometri e della fluorescenza rossa da 629 a 661 nanometri. Quindi scegli una potenza e un guadagno laser appropriati per evitare sovraesposizione e sottoesposizione.
Impostare le dimensioni del foro stenopeica su un'unità d'aria o una fetta ottica di circa 0,8 micrometri. Quindi impostare le dimensioni dell'immagine su 512 per 512 pixel e la velocità di scansione su due. Scegli una media di linea di due usando l'opzione media.
Preparare 100 microlitri di soluzione salina fisiologica sterile con 0,4% di glucosio titolazione a pH sette. Quindi fare una soluzione stock di C-SNARF-4 e aggiungere il colorante a una concentrazione finale di 30 micromolare. Svuotare uno dei pozzi con il biofilm cross-kingdom lasciando un serbatoio di 20 microliter e aggiungere la salina con glucosio e colorante ratiometrico.
Posizionare la piastra sullo stadio del microscopio e iniziare l'imaging. Preparare una serie di tampone MES da 50 millimolare titolazione a pH da quattro a 7,8 negli incrementi di 0,2 unità di pH a 35 gradi Celsius. Pipetta 150 microlitri di ogni soluzione tampone nei pozzi di una piastra ottica inferiore da 96 pozzi.
Aggiungere il colorante ai pozzali riempiti tampone ad una concentrazione di 30 micromolari e lasciarlo equilibrare per cinque minuti. Riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi Celsius e scegliere le stesse impostazioni dell'imaging pH ratiometrico descritto in precedenza. Posizionare la piastra da 96 punti sullo stadio del microscopio e concentrarsi sul fondo dei pozzi.
Acquisire immagini di canali verdi e rossi per tutte le soluzioni buffer. A intervalli regolari, scatta immagini con il laser spento per correggere l'offset del rilevatore. Eseguire l'esperimento di calibrazione in triplice copia ed esportare tutte le immagini come file TIFF.
Archiviare le immagini verdi e rosse in cartelle separate e rinominare entrambe le serie di file con numeri sequenziali. Importare le immagini in software di analisi delle immagini dedicato come ImageJ. Nelle immagini scattate con il laser spento, fare clic su analisi e istogramma per determinare l'intensità media della fluorescenza.
Sottrarre questo valore dalle immagini del biofilm facendo clic su processo, matematica e sottrazione. Quindi importare le due serie di immagini in daime ed eseguire una segmentazione basata sulla soglia delle immagini del canale rosso facendo clic sul segmento, sulla segmentazione automatica e sulla soglia personalizzata. Impostare la soglia bassa al di sopra dell'intensità di fluorescenza del citoplasma fungino e la soglia elevata al di sotto dell'intensità delle pareti cellulari fungine e dei batteri.
Quindi trasferire il livello oggetto della serie di immagini segmentate nella serie di immagini del canale verde facendo clic sul segmento e sul livello dell'oggetto di trasferimento. Eliminare i pixel non oggetto nella serie di canali rosso e verde. Ora le immagini del biofilm sono cancellate da cellule batteriche e fungine e possono essere esportate come file TIFF.
Importate di nuovo la serie di immagini in ImageJ e dividete la serie di immagini rosse da sola. Quindi moltiplicare il risultato per la serie di immagini originale. La serie di immagini risultante è identica all'originale, tranne per il fatto che tutti i pixel a intensità zero vengono rimossi.
Ripetere il processo con la serie di immagini verdi. Quindi, utilizzare il filtro medio su entrambe le serie di immagini per compensare il rumore del rilevatore. Dividi il verde per la serie di immagini rosse che quindi produce il rapporto verde-rosso per tutti i pixel degli oggetti.
Robusti biofilm cross-kingdom sviluppati nelle piastre del pozzo dopo 24 e 48 ore. Singole cellule e catene di S.mutans raggruppate attorno a ife fungine e grandi spazi intracellulari indicavano la presenza di una matrice voluminosa. Il pH nello spazio extracellulare è stato visualizzato utilizzando una tabella di ricerca.
Il pH extracellulare nei biofilm è diminuito rapidamente nei primi cinque minuti dopo l'esposizione al glucosio. Successivamente, l'acidificazione ha rallentato raggiungendo in genere valori da 5,5 a 5,8 dopo 15 minuti. A causa dei cambiamenti di pH locali, l'intensità della fluorescenza nei biofilm è cambiata nel tempo.
Durante la segmentazione delle immagini, sono state scelte soglie alte e basse per eliminare adeguatamente tutte le aree coperte da cellule batteriche e fungine. Le aree blu e verdi sono state eliminate rispettivamente dalle soglie basse e alte. L'attenta scelta dei parametri di acquisizione delle immagini è fondamentale per ottenere un buon contrasto tra cellule batteriche, cellule fungine e matrice di biofilm.
Se i biofilm cross-kingdom vengono coltivati in cellule di flusso, gli sviluppi del pH possono essere monitorati in condizioni di flusso imitando quelli nella cavità orale. La ratiometria del pH è stata utilizzata per identificare le aree locali nei biofilm dentali con pH particolarmente basso, i cosiddetti hotspot acidogenici.
