Abbiamo delineato una procedura per rilevare e quantificare l'acido iofenossico nel siero di mangusta. I risultati suggeriscono che l'acido iofenossico può essere usato come marcatore biologico per verificare l'assorbimento beta nella specie. Il principale vantaggio di questo metodo è che consente la quantificazione degli analoghi dell'acido iofenossico a parti per miliardo di livelli, utilizzando una semplice tecnica di precipitazione proteica.
Per la fase A mobile, combinare un millilitro di acido formico con un litro di acqua ultra pura. Per la fase mobile B, combinare un millilitro di acido formico con un litro di acetonitrile. Per il diluente, unire un millilitro di acido trifluoroacetico con 200 millilitri di acetonitrile.
Successivamente, pesare circa 10 milligrammi di metil-IPA sul microbilanciamento e registrare la massa a più o meno 0001 milligrammi. Trasferire quantitativamente il metil-IPA in un matraccio volumetrico di classe A da 10 millilitri, utilizzando da quattro a cinque millilitri di acetonitrile. Sonicare per un minuto per sciogliere tutti i solidi e quindi portare a volume con acetonitrile.
Trasferire circa otto millilitri di ogni stock in otto flaconcini di vetro ambrato millilitro con tappi rivestiti in PTFE e conservare i campioni a temperatura ambiente. Quindi, trasferire lo stock rimanente su rifiuti pericolosi. Per lo stock 25X sette stock di metil-IPA preparano uno stock di metil-IPA e acetonitrile a circa 200 microgrammi per millilitro.
Trasferire un millilitro del materiale in un pallone da cinque millilitri e diluire in volume con acetonitrile. Quindi, trasferire il materiale in una fiala di vetro ambrato da otto millilitri con un cappuccio foderato in PTFE e conservare a temperatura ambiente. Utilizzando un pipettor ripetuto, preparare le sei scorte aggiuntive di metil-IPA 25X descritte nel protocollo di testo in otto flaconcini di vetro ambrato millilitro con tappi rivestiti in PTFE e conservare a temperatura ambiente.
Per lo stock surrogato 25X, trasferire 0,1 millilitri del materiale etilico-IPA concentrato in un matraccio volumetrico di classe A da 10 millilitri utilizzando una siringa di vetro da 100 microlitri e quindi diluire in volume con acetonitrile. Trasferire circa otto millilitri del calcio surrogato in una fiala di vetro ambrato da otto millilitri con cappuccio foderato in PTFE e conservare a temperatura ambiente. Trasferire lo stock rimanente su rifiuti pericolosi.
Successivamente, preparare scorte 4X contenenti sia metil-IPA che etile-IPA in flaconcini campionatore automatico in vetro a vite da 10 millilitri, come descritto nel protocollo di testo. Ad esempio, per preparare lo stock 4X7, aggiungere 0,2 millilitri dello stock 25X sette stock di metil-IPA a una fiala a due millilitri utilizzando il pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri. Aggiungere 0,2 millilitri del materiale etilico-IPA surrogato 25X utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri.
Aggiungere 0,85 millilitri di acetonitrile utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di un millilitro. Cappucci la fiala in modo sicuro e inverti cinque volte per mescolare. In seguito, preparare la curva standard in due flaconcini campionatore automatico a vite millilitro come descritto nel protocollo di testo.
Ad esempio, per preparare il sette standard, aggiungere 0,2 millilitri del materiale 4X7 a una fiala a due millilitri, utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri. Aggiungere 0,6 millilitri di acqua ionizzata ultra purezza utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di un millilitro. Fissare le fiale in modo sicuro e invertire cinque volte per mescolare.
Per ogni campione, preparare un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri contenente da 200 a 300 milligrammi di cloruro di sodio e disporre i tubi in un rack di plastica a 80 punti. Per ogni campione, etichettare un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri come A e un secondo tubo di micro centrifuga come B.Disporre i tubi in un rack di plastica a 80 posti. Posizionare i seguenti materiali e attrezzature necessari per l'estrazione del siero in un armadio per la biosicurezza di classe due: i tubi di micro centrifuga, un miscelatore a vortice, un pipettor ripetuto con punte da 0,5 milliliter e cinque punte di capacità millilitro, una pipetta di spostamento dell'aria da 100 a 1000 microlitri con punte di 1000 microlitri, contenitori con circa 100 millilitri ciascuno di acqua ionizzata diluita e ultra purezza e contenitore di rifiuti a rischio biologico.
Quindi, rimuovere i campioni di siero dalla conservazione congelata e dalla temperatura calda a temperatura ambiente nell'armadio della biosicurezza. I vortici mescolano ogni campione di siero prima del campionamento. Utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri, erogare 05 millilitri di siero di mangusta nel tubo A e aggiungere 05 millilitri del calcio surrogato 25X.
Quindi aggiungere 0,95 millilitri di diluente al tubo A utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di cinque millilitri. Fissare i tubi in modo sicuro e mescolare il vortice per 10-15 secondi. Aggiungere quindi il siero di mangusta di controllo al tubo A.Fortificare ciascuno dei campioni 4QC con me-IPA utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri.
Aggiungere il materiale surrogato 25X ai campioni qc. Quindi, aggiungere il diluente ai campioni qc. Limitare i tubi e il mix di vortici.
Distribuire il cloruro di sodio pre-pesato nel tubo A e mescolare il vortice tre volte per otto-12 secondi. Quindi, pulire le superfici esterne del rack del flaconcino contenente il tubo A utilizzando il 70% di isopropanolo. Dopo aver rimosso i campioni dall'armadio di biosicurezza, centrifugare tubo A a 1200 volte G per un minuto per separare le fasi acquose e acetonitrile.
Pipetta da 0,8 millilitri della fase superiore dell'acetonitrile al tubo B, utilizzando una pipetta di spostamento dell'aria da 100 a 1000 microlitri. Trasferire la soluzione rimanente nel tubo A in rifiuti pericolosi e scartare il tubo vuoto in un contenitore di rifiuti rischiosi. Ora, rimuovere acetonitrile e trifluoroacetico dal tubo B con un flusso delicato di gas azoto in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius.
Aggiungere 0,25 millilitri di acetonitrile al tubo B utilizzando un pipettor ripetuto e una miscela di vortici per quattro o cinque secondi. Quindi, centrifugare a 1200 volte G per due o quattro secondi per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo. Dopo la centrifugazione, aggiungere 0,75 millilitri di acqua deionizzata ultra pura al tubo B utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di cinque millilitri e una miscela di vortici per quattro o cinque secondi.
Centrifuga a 1200 volte G per un minuto per chiarire il campione. Quindi, trasferire 0,75 millilitri del supernatante su una fiala del campionatore automatico utilizzando una pipetta di spostamento dell'aria da 1000 microlitri e scartare le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti a rischio biologico. Limitare saldamente ogni flaconcino del campionatore automatico per l'analisi LC-MS/MS.
Trasferire la soluzione rimanente nel tubo B in rifiuti pericolosi e scartare il tubo vuoto in un contenitore di rifiuti rischiosi. Configurare l'LC-MS/MS con tutti i parametri descritti nel protocollo di testo. Accensione dell'LC-MS/MS e consentire alla colonna di raggiungere i 70 gradi Celsius prima di impostare la portata su 0,8 millilitri al minuto.
Impostare una sequenza nel software di acquisizione dati per iniettare la curva standard prima e dopo ogni lotto costituita da campioni di controllo qualità e campioni sconosciuti. Iniettare tutti gli standard e i campioni e acquisire cromatogrammi ionici MR utilizzando parametri elencati nel protocollo di testo. Dopo il completamento della sequenza, spegnere l'LC-MS/MS e smaltire tutte le fiale del campionatore automatico nei rifiuti pericolosi.
Il cromatogramma ionico del siero di mangusta di controllo illustra il tempo di ritenzione dell'etile-IPA e l'assenza di metil-IPA al tempo di ritenzione indicato. Il cromatogramma ionico del campione di controllo qualità illustra la separazione di base del metil-IPA dall'etile-IPA, nonché le transizioni quantificatore e qualificatore per il metil-IPA. Il cromatogramma ionico del campione rappresentativo dello studio mostra una concentrazione siere osservata di 33,5 microgrammi per microlitro di metil-IPA.
I risultati di precisione e precisione per il controllo del siero di mangusta fortificato con metil-IPA sono mostrati qui. La percentuale di recuperi variava dal 96,9% al 109%La deviazione relativa percentuale ai tre livelli di fortificazione era rispettivamente del 3,4%1,7% e del 2,3%. I risultati di precisione e precisione per il controllo del siero di mangusta fortificato con etile-IPA sono mostrati qui.
La percentuale di recuperi variava dall'89,5% al 115%La percentuale di deviazione standard relativa ai cinque livelli di fortificazione era rispettivamente del 4,3% 1,5%2,3%5,6% e dell'1,1%. Tutte le manguste offrivano etile-IPA e esche metil-IPA consumavano almeno il 25% dell'esca entro il vincolo di 24 ore e avevano livelli quantificabili di etile-IPA e metil-IPA nei loro sieri, rispettivamente. La potenziale utilità del metodo potrebbe essere aumentata configurando l'LC-MS per raccogliere dati per altri analoghi dell'acido iofenossico, come l'acido propile e butile iofenossico.
Abbiamo incoraggiato il personale a consultare le più recenti raccomandazioni del comitato consultivo sulle pratiche di immunizzazione o del suo comitato istituzionale per la biosicurezza per ottenere indicazioni sulla necessità di una vaccinazione antirabbica preesposizione. Le sezioni da 2.3 a 2.6 di questo protocollo che comporta l'uso di siero non diluito devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe due.
