Questo protocollo è significativo in quanto descrive un metodo che può essere utilizzato per separare diversi segnali fluorescenti in un singolo campione. Rispetto ai metodi tradizionali, l'eccitazione-scansione può aumentare la velocità dell'esperimento e migliorare la sensibilità dei dati. Utilizzando diverse fonti di illuminazione come un laser supercontinuo, questo metodo può essere applicabile ai sistemi di microscopio confocale a scansione laser o disco rotante.

Quando si eseguono scansioni di eccitazione, microscopia a imaging spettrale, è importante verificare che il picco di eccitazione di ogni etichetta fluorescente si verifichi a una lunghezza d'onda diversa. Per iniziare, impostare un microscopio a fluorescenza invertito e una fotocamera come descritto nel protocollo di testo. Quindi caricare il campione sul palco.

Dal menu a discesa della finestra principale del micromanager, selezionare 475 nanometri per la visualizzazione iniziale del campione. Quindi fare doppio clic nella casella accanto all'esposizione e immettere 100 per impostare il tempo di esposizione su 100 millisecondi. Infine, fai clic dal vivo per visualizzare l'esempio.

Ora clicca su Auto. Pulsante dell'intervallo di visualizzazione dell'intensità automatica per portare i valori minimo e massimo in intervalli visivi significativi. Quindi, utilizzare le manopole di messa a fuoco del microscopio per mettere a fuoco il campione.

Una volta messa a fuoco, regolare la posizione del campione in modo che il bordo si trova al centro del campo visivo. Quindi mettere a punto la messa a fuoco. L'esempio è a fuoco quando le caratteristiche del bordo nell'immagine appaiono nitide.

Ora, apri lo strumento di acquisizione multidimensionale. Nel menu, fate clic sul pulsante di caricamento e scegliete un'impostazione preimpostata contenente un intervallo di lunghezze d'onda appropriato per l'acquisizione spettrale. Una volta confermate le impostazioni di acquisizione, spostarsi in un'area vuota del campione e fare clic su acquisisci per raccogliere uno stack di immagini spettrali contenente sfondo e rumore da utilizzare per la sottrazione in un secondo momento.

Quindi, spostati sul campione per trovare le regioni più luminose. È probabile che i campioni abbiano una fluorescenza più intensa lontano dal bordo del campione. Una volta posizionata la regione più luminosa, prendi una singola pila di immagini.

Carica l'immagine acquisita nell'immagine J e usa la funzione di misura di Image J per confermare che nessuna lunghezza d'onda contiene pixel sovraesposti. Se è necessario un tempo di esposizione ridotto a causa della sovraesposizione, l'immagine di sfondo deve essere riascritta anche con un nuovo tempo di esposizione. Se è stato rilevato che una delle immagini contiene il limite di rilevamento verso l'alto della fotocamera, regolare il tempo di esposizione della scansione spettrale per garantire che il segnale massimo in tutto l'intervallo spettrale non superi l'intervallo dinamico della fotocamera.

Con un tempo di esposizione adeguato ora determinato, posizionare un campione senza etichetta sul palco. Acquisire dati di immagine spettrale dal campione senza etichetta per determinare se esiste un'autofluorescenza sottostante. Quindi, posizionare un campione con etichetta singola sul palco.

Acquisire dati di immagine spettrale da ciascuno dei campioni con etichetta singola da utilizzare come controlli spettrali per costruire una libreria spettrale. Eseguire la scansione per ogni campione di controllo utilizzando un intervallo di lunghezze d'onda identico, il tempo di esposizione e le impostazioni della fotocamera. Quindi, posizionare una diapositiva contenente il campione sperimentale al microscopio.

Selezionare un campo visivo con celle etichettate in modo appropriato e acquisire i dati dell'immagine spettrale dall'esempio utilizzando le impostazioni di acquisizione determinate. Correggere le immagini a una risposta spettrale piatta sottraendo lo spettro di sfondo dall'immagine campione e moltiplicando l'immagine per il coefficiente di correzione. Qui, uno script MATLAB viene utilizzato per elaborare rapidamente le immagini.

Quindi, generare la libreria spettrale. Per ottenere i migliori risultati, normalizzare ogni membro finale alla banda di lunghezza d'onda della massima intensità determinando quale banda di lunghezza d'onda ha il valore più intenso e dividendo la misurazione ad ogni banda di lunghezza d'onda per quel valore massimo. Quindi salvare i dati spettrali come file dat.

Al termine, unmix i dati dell'immagine spettrale. Il passaggio di unmixing genererà un'immagine di abbondanza per ogni etichetta fluorescente, dove l'abbondanza è la quantità di segnale fluorescente relativo nell'immagine dall'etichetta prospettica. Quindi, apri ogni immagine non mixed per ispezionare visivamente la distribuzione dei componenti puri.

Confrontare la grandezza dell'immagine di errore con quella delle immagini non mixate. Se la grandezza dell'immagine di errore è simile alle immagini di abbondanza non mixed, i segnali nei dati dell'immagine spettrale potrebbero non essere accuratamente contabili. Infine, verificare che non vi siano strutture residue non identificate confrontando l'immagine di errore con le immagini non mixate.

Se eseguito correttamente, il processo di unmixing spettrale consente la separazione di una pila di immagini spettrali nei rispettivi contributi da ogni etichetta di fluorescenza. Qui, un set di immagini spettrali non mixed con singole immagini che evidenziano l'autofluorescenza liscia delle cellule muscolari delle vie aeree, una sonda GCaMP e un'etichetta mitocondriale. Vi è un elevato errore associato alle regioni nucleari e perinucleari delle cellule che indica che gli spettri misurati di tali regioni non sono ben contabiliggiati dagli spettri della biblioteca spettrale.

Gli spettri puri raccolti da cellule etichettate che sono anche autofluorescenti probabilmente contamineranno il profilo spettrale per il componente puro. Qui, si può vedere la differenza di unmixing con spettri puri contaminati da autofluorescenza, rispetto agli spettri puri corretti dopo la sottrazione scalata. Una corretta acquisizione dei dati è essenziale quando si diagnosticano campioni sensibili in quanto possono sopravvivere solo a una singola sessione di imaging a differenza dello sfondo e dei controlli che possono essere ricreati.

Assicurarsi che le impostazioni hardware e di acquisizione corrette siano predeterminate il più possibile. Come passo successivo, i video creati da dati time-lapse acquisiti utilizzando questo sistema possono essere utilizzati per tracciare le sorgenti fluorescenti in luoghi discreti nel tempo come la localizzazione del secondo segnale messenger. Prestare attenzione quando si utilizzano potenti sorgenti luminose per evitare l'esposizione agli occhi.

Inoltre, assicurati di indossare guanti adeguati quando maneggia etichette biologiche.