È difficile modulare l'espressione genica negli isolotti umani, anche un maggiore declino degli isolotti umani funzionanti pone grandi sfide dopo la modulazione dell'espressione genica. Combinando la trasduzione mediata da lentivirus SHR8 e la formazione di isolotti adatti all'uomo. Questo protocollo consente un'efficiente downregulation di un gene mirato preservando la funzione isolotto durante la coltura prolungata.
Per iniziare, ruotare delicatamente la bottiglia di spedizione per mantenere gli isolotti in sospensione. Trasferire il mezzo di spedizione contenente isolotti in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri. Lasciare riposare il tubo in un armadietto di sicurezza biologico per 15 minuti in modo che gli isolotti si sistemino sul fondo del tubo.
Rimuovere delicatamente il mezzo di spedizione utilizzando una pipetta capillare senza disturbare il pellet di isolotto. Sospendere di nuovo il pellet di isolotto nel mezzo CMRL con albumina siere umana all'1% a una concentrazione di 400 isolotti equivalenti per millilitro. Trasferire gli isolotti in un piatto trattato con coltura non tissutale e coltarli a 37 gradi celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% durante la notte.
Dopo la coltura notturna, trasferire isolotti umani in un tubo di centrifuga conico da 15 millilitri, centrifugare a 250 volte g per cinque minuti in un rotore a secchio oscillante. E aspirare il mezzo con una pipetta capillare senza disturbare il pellet di isolotto. Lavare il pellet aggiungendo 10 millilitri di PBS al tubo, mescolare delicatamente e centrifugare a 250 volte g per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, aspirare PBS senza disturbare il pellet di isolotto. Sospendere di nuovo il pellet in 0,5 millilitri di una miscela enzimatica proteolitica e collagenolitica prerimpita. Pipetta cinque volte utilizzando una pipetta P1000 per mescolare isolotti.
Incubare a 37 gradi celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, mescolare delicatamente la pipetta che accarezza su e giù. Verificare la nuvolosità a singola cella e il numero di fiocchi o isolotti non digeriti.
Mettere un colino da 40 micron in una piastra di Petri di 35 millimetri e bagnare il colino aggiungendo un millilitro di mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10% e deprimente con uno stantuffo per siringhe da un millilitro. Trasferire tutte le sospensioni cellulari sopra il filtro. E raccogliere il passaggio attraverso in un tubo fresco da 15 millilitri.
Lavare il tubo utilizzato per la digestione dell'isolotto con 0,5 millilitri di mezzo CMRL fresco per raccogliere le cellule rimanenti e passare il lavaggio attraverso il colino. Unire il passaggio in un tubo da 15 millilitri. Ripeti una volta.
Per dissociare gli isolotti non digeriti rimasti sul colino, premere il colino con uno stantuffo per siringhe millilitro. Raccogliere nuovamente il passaggio e lavare il colino con un mezzo CMRL 1066 fresco e semplice per rimuovere tutti gli isolotti digeriti rimanenti dal colino e dal piatto. Aggiungere il passaggio al tubo da 15 millilitri.
Registrare il volume totale della sospensione cellulare e prendere un'aliquota di 10 microliter di cellule per contare il numero di cellulare su un emocitometro. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare per cinque minuti a 200 volte g, rimuovere il mezzo senza disturbare il pellet. Per produrre pseudo-isolotti utilizzando una piastra di attacco 96 ben ultra bassa, prima calcola il volume totale delle celle richieste una volta 10 alla quinta per millilitro della sospensione a singola cella.
Quindi, sospendere di nuovo il pellet di isolotto nel mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10% in modo che 30 microlitri della sospensione cellulare abbia 3000 cellule. Successivamente, trasferire il volume richiesto della sospensione a cella singola in un tubo fresco da 15 millilitri. A 250 unità di trasduzione per cellula di un lentivirus contenente SH-RNA che prende di mira un gene di interesse o un controllo.
Per mescolare la sospensione cellulare con il virus, pipettare delicatamente cinque volte con una pipetta P1000. Quindi trasferire le cellule miste in un serbatoio di reagente sterile da 50 millilitri se si utilizza una pipetta a otto canali. Con una pipetta a otto canali o una pipetta P200, erogare 30 microlitri per pozzo della sospensione cellulare mescolata con lentivirus in ogni pozzo.
Quindi, centrifugare la piastra del pozzo 96 in una centrifuga a benna oscillante a 270 volte g a temperatura ambiente per sette minuti. Coltura a 37 gradi celsius in un incubatore umidificato del 5% di anidride carbonica durante la notte. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra del pozzo 96 dall'incubatrice e posizionarla nell'armadio di sicurezza biologico.
Pipetta 100 microlitri per isolotto di FBSCMRL alto 10% in un pozzo per evitare l'essiccazione degli isolotti e continuare a coltura per una settimana. Pipetta 100 microlitri per pozzo di mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10% dal serbatoio agli pseudo-isolotti e pipetta su e giù da due a tre volte delicatamente nel pozzo per sollevare gli isolotti. Quindi, aspirare il mezzo nel pozzo contenente uno pseudo-isolotto ed espellere in una piastra di petri di 10 centimetri.
Controllare la piastra al microscopio luminoso per garantire la completa rimozione di tutti gli pseudo-isolotti e procedere agli esperimenti a valle. Per produrre pseudo-isolotti utilizzando una piastra di coltura di 24 micro pozzi, aggiungere prima 500 microlitri per pozzo di una soluzione di risciacquo anti-aderenza. Centrifuga a 1300 volte g per cinque minuti in una centrifuga a benna oscillante.
Quindi, osservare la piastra al microscopio per assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dai micro-pozzi. In un armadio di sicurezza biologico, aspirare la soluzione di risciacquo anti-aderenza dai pozzi. Risciacquare ogni bene con due millilitri di caldo mezzo CMRL 1066 una volta.
Quindi, aspirare il semplice mezzo CMRL 1066 e aggiungere 0,5 millilitro per pozzo di CMRL caldo con siero bovino fetale inattivato al 10% a ciascuno ben pianificato per l'uso. Determinare il numero totale di celle necessarie per ogni pozzo. Sospendere di nuovo le singole cellule in 0,8 millilitri di mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore al 10% in un tubo sterile da 1,5 millilitri.
Per creare un pozzo di pseudo-isolotto trasdotto da un lentivirus, aggiungere 125 unità di trasduzione per cellula alla sospensione a singola cellula mantenendo il volume del virus al di sotto di 0,2 millilitri. Incubare la miscela cellulare e virale a 37 gradi Celsius con miscelazione delicata occasionale per un'ora per consentire il contatto delle cellule con il virus prima della condensazione delle cellule. Dopo un'ora, regolare il volume totale della cellula isolotto e della miscela virale su un millilitro aggiungendo il mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10%.
Se le cellule formano grumi dopo un'ora di incubazione, disperdersi in una singola sospensione cellulare mediante pipettazione delicata e rapida da due a tre volte. Trasferire la sospensione cellulare in un pozzo della piastra di coltura del micro-pozzo da 24 pozzi. Immediatamente dopo la pipettazione, centrifugare a 100 volte g a temperatura ambiente per tre minuti per catturare le cellule in tutti i micro-pozzi.
Osservare al microscopio per verificare che le cellule siano distribuite uniformemente in tutti i micro-pozzi. È fondamentale centrifugare la piastra del micro-pozzo subito dopo aver aggiunto il pozzo mescolando la sospensione a cella singola dell'isolotto nei pozzi. I cambiamenti sequenziali nella morfologia degli pseudo-isolotti da 3000 cellule isolotti umane creati in una piastra di attacco ben ultra bassa hanno mostrato monostrato o ciuffi sciolti di cellule trasformate in aggregati solidi con un bordo rotondo liscio in una settimana.
Al contrario, in una piastra di coltura di micro-pozzi, la formazione di cellule e pseudo-isolotti da sole 500 cellule isolotti è solitamente visibile entro quattro giorni. La dimensione uniforme degli pseudo-isolotti riduce la variazione all'interno di un gruppo di prova e consente l'incubazione statica utilizzando solo cinque pseudo-isolotti per misurazione. Il Perry Fusion Assay per la risposta all'insulina ha mostrato che gli pseudo-isolotti umani hanno mantenuto una robusta secrezione di insulina della prima fase in risposta al glucosio dopo sette giorni di coltura.
L'introduzione del lentivirus che prende di mira la trigliceridi lipasi adiposa umana o perilipin cinque geni in una sospensione a singola cellula garantisce la trasduzione efficiente e omogenea delle cellule isolottiche e raggiunge una downregulation altamente efficiente dei geni. È importante ricordare che il tempo necessario per disperdere l'isolotto umano in singole cellule è influenzato da molti fattori come: dimensioni, distribuzione e caratteristica del donatore. Quindi, è importante prestare molta attenzione alla scomparsa degli isolotti umani durante la digestione.
In tutto il protocollo è importante gestire delicatamente la sospensione a cella singola per evitare la perdita di cellule. Gli pseudo-isolotti umani creati possono essere usati per molte applicazioni per determinare l'effetto della modulazione genica come:Western Blot, studio istologico e misurazioni dei tassi di consumo di ossigeno. Questo protocollo consente di valutare il basso livello di gene mirato nella regolazione della salute degli isolotti e la funzione negli isolotti umani utilizzando software da laboratorio comuni e tecniche semplici.
L'uso di isolotti umani può richiedere l'approvazione preventiva di un comitato di revisione locale. Si prega di consultare il comitato di revisione locale prima dell'inizio dello studio. Il lentivirus è classificato come livello di biosicurezza due.
Contattare il comitato di biosicurezza prima dell'inizio dell'uso del lentivirus.
