FILM-FRET è una tecnica potente che consente di confermare le interazioni proteina-proteina sospette o previste. In questo protocollo, presentiamo un modo per analizzare i dati in particolari casi di quantità di donatori e accettori squilibrati. FILM-FRET è in grado di fornire informazioni sulle interazioni proteina-proteina direttamente nelle cellule vive.
È importante indagare le interazioni personali-proteiche nell'ambiente cellulare nativo, in particolare quando le proteine fluorescenti sono espresse nel livello endogeno. Inizia coltivando batteri aiutanti P.aeruginosa, E.coli TOP10 ed E.coli ciascuno in cinque millilitri di LB senza antibiotico a 30 gradi Celsius mentre tremano durante la notte. Il giorno successivo, misurare la densità ottica delle colture e mescolare una quantità uguale di P.aeruginosa, E.coli TOP10 ed E.coli aiutante in un microtubo da 1,5 millilitri.
Centrifugare il tubo per cinque minuti a 9,300 volte G per pellettare i batteri, quindi scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 50 microlitri di LB. Placcare un punto della miscela sull'agar LB preriscaldato e incubarlo per cinque ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raschiare il punto con un ciclo di inoculazione sterile e rimescolarlo in un millilitro di LB. Piastra 100 microlitri di questa sospensione batterica su agar LB contenente 10 microgrammi per millilitro cloramfenicolo e 30 microgrammi per millilitro gentamicina e incubare due giorni a 37 gradi Celsius per eliminare I batteri aiutanti E.coli TOP10 ed E.coli. Rimescolare una colonia in un millilitro di LB e incubarla a 37 gradi Celsius con scuotimento orbitale per quattro ore, quindi centrifugare il tubo per tre minuti a 9,300 volte G e scartare 950 microlitri di supernatante.
Resuspend il pellet in 50 microlitri di LB e isolare la miscela su agar LB contenente saccarosio e nessun cloruro di sodio. Incubare il piatto durante la notte a 30 gradi Celsius. Individuare colonie isolate su agar LB e agar LB contenenti 15 milligrammi per millilitro gentamicina al fine di verificare la sensibilità alla gentamicina.
Posizionare uno scivolo di vetro al microscopio su una superficie orizzontale piatta e disporre due vetrini sormontati da due strati di nastro adesivo intorno ad esso. Pipettare una goccia da 70 microliter di agarosio fuso all'1% sullo scivolo di vetro e posizionare una quarta diapositiva sopra per appiattire la goccia di agarosio. Premere delicatamente verso il basso per circa un minuto.
Togliere lo scivolo superiore e far cadere circa tre microlitri di batteri in tre o quattro punti in diverse posizioni sul tampone di agarosio. Coprire il tampone di agarosio con un coverslip in vetro al microscopio e fissarlo con paraffina fusa per sigillare sullo scivolo di vetro a partire dai quattro angoli. Posizionare la diapositiva di microscopia sul palco con la coverlip rivolta verso l'obiettivo.
Ruotare la torretta del cubo del filtro per selezionare il cubo eGFP e aprire l'otturatore della lampada a fluorescenza, quindi inviare la luce di fluorescenza verso l'oculare del microscopio. Focalizzare l'obiettivo sui batteri utilizzando la manopola del microscopio. Selezionare un'area di interesse nel campione utilizzando il joystick che controlla lo stadio motorizzato.
Inviare il percorso di emissione di fluorescenza verso il rivelatore, quindi tornare indietro la torretta del cubo del filtro per selezionare il cubo dicroico per il laser da 930 nanometri e impostare la potenza del laser su 20 milliwatt. Impostare la dimensione della regione di interesse su 30 micrometri che regola la tensione che opera gli specchi galvo e definisce la gamma dei loro movimenti. Accendere il rilevatore e iniziare la scansione del campione.
Scegliere il campo visivo per l'imaging spostando finemente il palco dall'interfaccia del computer. Questo può essere fatto sulla configurazione spostando la croce sull'immagine nel software di controllo del microscopio che definirà il nuovo centro dell'immagine e premendo lo stadio di spostamento. Un buon campo visivo per l'acquisizione dovrebbe contenere da 10 a 30 batteri immobili tutti a fuoco.
Se sei interessato all'estrazione di dati FILM-FRET a singole cellule, assicurati che i batteri siano ben individualizzati. Aprire il software di imaging e verificare che il tasso di conteggio dei fotoni non sia troppo elevato per evitare un effetto di accumulo che può influenzare le misurazioni a vita. Se necessario, abbassare l'intensità del laser per mantenere bassa la velocità di conteggio dei fotoni.
Regolare i parametri di acquisizione, incluso il tempo di raccolta dell'acquisizione. Premere il pulsante start e attendere il completamento dell'acquisizione. Per analizzare i dati, aprire RStudio e creare un nuovo progetto.
Creare una nuova cartella nella cartella principale del progetto e denominarla dati, quindi spostare tutti i file ask dell'analisi in questa cartella. Aprire un nuovo file script o uno script aggiuntivo flim_analysis.r. Installare il pacchetto FlimDiagRam dedicato per l'analisi dei dati del film e chiamare il pacchetto nell'area di lavoro.
Qui sono mostrate le funzioni di distribuzione cumulativa empirica delle durate di fluorescenza misurate per i diversi ceppi batterici. Se si verifica FRET, le funzioni vengono spostate verso le vite più brevi. È importante notare che fret non può verificarsi quando l'interazione delle due proteine si traduce in una lunga distanza tra i due flurofori, che non può essere distinta dall'assenza di interazione.
Pertanto, potrebbe essere necessario etichettare le proteine in diverse posizioni per massimizzare le possibilità di sondare l'interazione. A causa della grande differenza nelle espressioni proteiche tra PvdA e PvdL, lo stesso complesso non si traducono in dati FILM-FRET simili. Le stechiometrie sbilanciate portano a differenze nel contributo del libero rispetto alle proteine associate etichettate dal donatore nella distribuzione della durata di fluorescenza registrata.
Il diagramma grafico può essere utilizzato per fornire informazioni critiche sulla stechiometria. Nel mutante PvdA-eGFP mCherry-PvdL, la quantità di PvdA etichettato come donatore è molto più alta della quantità di mCherry-PvdL. Tra tutti i donatori presenti nel campione, solo alcuni di loro interagiscono con PvdL.
Il singolo valore tau uno centrato a circa 2,3 nanosecondi suggerisce che ogni donatore di PvdA-eGFP può essere trasferito solo con un accettore mCherry-PvdL. Quando l'etichettatura è invertita, si prevede che la maggior parte delle proteine eGFP-PvdL interagisca con PvdA-mCherry, il che è confermato dai valori alfa uno più alti. I valori di tau one divennero più distribuiti suggerendo che più proteine PvdA possono legarsi ad una singola proteina PvdL.
La configurazione FLIM sta diventando disponibile in un numero crescente di strutture di imaging. L'imaging di campioni in un FILM-FRET non è più complicato dell'imaging in microscopia video.
