Il protocollo FASP è un approccio interessante alla proteomica urinaria per la sua compatibilità con tamponi fortemente denaturanti e per la sua capacità di concentrare il campione sul filtro, che è fondamentale per un campione di proteine diluite. Il protocollo FASP abbinato alla spettrometria di massa di analisi indipendente dai dati ci consente di ottenere una copertura proteoma profonda nelle urine EPS, che viene raccolta urina dopo l'esame rettale digitale. Attualmente stiamo applicando il metodo che stai per vedere in uno sforzo di scoperta del biomarcatore sul cancro alla prostata.
La procedura sarà illustrata da Licia Prestagiacomo, Paola Morelli e Caterina Gabriele. Centrifugare campioni di urina EPS entro due ore dalla raccolta per 10 minuti a 2.100 RCF a temperatura ambiente. Quindi, conservare i supernatanti a meno 80 gradi centigradi fino all'uso.
Getta i campioni sul ghiaccio, o a quattro gradi. Per accelerare la procedura, è possibile trasferire i campioni da meno 80 a meno 20 il giorno precedente la digestione. Come soluzioni stock, avrai bisogno di 500 DTT millimolare, 10%SDS, un buffer Tris molare a pH otto.
Diluire 500 microlitri di ciascun campione di urina EPS con 67 microlitri di SDS, 67 microlitri di DTT e 33 microlitri di tampone Tris. Incubare a 95 gradi centigradi per 10 minuti con tremori delicati. Assemblare l'unità filtrante centrifuga con un taglio di peso molecolare di 10.000 Dalton.
Quindi, aggiungere 300 microlitri di campione diluito di urina EPS al filtro. Centrifuga a 14.000 g per circa 20 minuti. È possibile interrompere temporaneamente la procedura dopo circa 15 minuti per verificare se la filtrazione procede senza intoppi.
Continuare fino a quando l'intera soluzione non è passata attraverso il filtro. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone di urea e centrifuga a 14.000 g per 15 minuti. Ripetere questo passaggio una seconda volta.
Quando il flusso sta per toccare il filtro, svuotare la raccolta Eppendorf pipettando il flusso-through. Le proteine sono sicure sul filtro. Per l'alchilazione della cisteina, preparare una soluzione di iodoacetamide immediatamente prima dell'uso.
Pesare circa 10 milligrammi di iodoacetamide in un numero di flaconcino Eppendorf e scioglierlo in tampone di urea ad una concentrazione di 9,25 milligrammi per ml, o in termini di molarità, 50 millimolare. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di iodoacetamide ad ogni filtro e centrifugare a 6.000 g per 25 minuti. La minore velocità di centrifugazione consentirà ai filtri di non esaurirsi.
Dopo l'alchilazione proteica, lavare i filtri con due aliquote consecutive da 200 microliter di tampone di urea e centrifuga a 14.000 g per 20 minuti. Scartare il flusso. Aggiungere 200 microlitri di 50 millimolare tre tamponi di bicarbonato di ammonio etilico e centrifugare a 14.000 g per 20 minuti.
Ripetere questo passaggio. Dopo aver completato completamente l'ultimo lavaggio in bicarbonato, trasferire l'unità filtrante in un nuovo tubo di raccolta. Quindi, aggiungere 60 microlitri di tampone TEAB da 50 millimolare.
Aggiungere un microlitro di soluzione di triptina ad una concentrazione di 200 nanogrammi per microlitro di tripina. In alternativa, è possibile preparare il tampone di digestione per tutti i campioni in una fiala Eppendorf e distribuire 61 microlitri del tampone di digestione a ciascun filtro. Se si utilizza un ThermoMixer per evitare l'evaporazione del campione durante l'incubazione notturna, avvolgere ogni unità filtrante con uno strato di foglio di alluminio e quindi uno strato di parafilm.
Incubare i campioni a 37 gradi durante la notte. La mattina seguente, trasferire i filtri su una centrifuga da banco per un giro molto breve. Dopo la filatura, aprire i coperchi Eppendorf e aggiungere 140 microlitri d'acqua.
Centrifugare le fiale a 14.000 g per 25 minuti, al fine di raccogliere i peptidi. Il volume raccolto dovrebbe essere di circa 190 microlitri. Al fine di rimuovere tracce di SDS dal digest, si raccomanda una forte purificazione dello scambio di cationi dei peptidi prima di LC-MS-MS.
Preparare i supporti a microcolonna perforando i coperchi Eppendorf con uno strumento affilato come un paio di pinzette o forbici. Il supporto può ospitare la microcolonna durante la centrifugazione. Dal momento che sono noiosi da preparare, i supporti possono essere utilizzati più volte.
Utilizzando un blunt e un ago, rimuovere una placca del disco di estrazione appropriato. I dischi di estrazione sono materiali polimerici morbidi contenenti particelle assorbenti. In questo caso, il assorbente è costituito da particelle con forti proprietà di scambio di cationi.
Ospitare la placca in una punta di pipetta da 200 microliter. Utilizzando un pistone spingere la spina verso l'estremità della punta. Il piccolo disco deve essere spinto saldamente, evitando tuttavia un'eccessiva resistenza.
Inserire la punta nel supporto e assemblare la microcolonna di spin utilizzando una fiala Eppendorf a due millilitri da cui è stato rimosso il coperchio originale. La spina di un ago calibro 16 avrà una capacità di carico di circa cinque microgrammi di peptidi. Condizionare la microcolonna con due lavaggi consecutivi.
La velocità appropriata dipenderà dalla forza con cui si spinge il disco nella punta della pipetta. Mira a raggiungere una portata dell'ordine di 20-30 microlitri al minuto. Cerca di non asciugare la punta durante i lavaggi e durante il caricamento del campione.
Diluire il campione di cinque volte nella soluzione di lavaggio due e caricare i risultati in soluzione a velocità più lenta. Puntare a una portata di circa 15-20 microlitri al minuto. Se necessario, scartare il flusso.
Lavare via i detergenti residui. Quindi, lasciare asciugare il disco prima dell'eluizione peptidica. Trasferire la microcolonna in un tubo pulito da 1,5 Eppendorf e aggiungere immediatamente l'eluente.
Che saranno sette microlitri di una soluzione di acetato di ammonio da 500 millimolare contenente il 20% di acetonitrile. Diluire l'eluito con 27 microlitri dello 0,1% di acido formico al fine di abbassare la percentuale di solvente organico e quindi iniettare due microlitri della soluzione risultante in LC-MS-MS con rilevamento in modalità dipendente dai dati. I dettagli sulla configurazione LC-MS utilizzata in questo protocollo verranno forniti più avanti nel video.
Dopo aver eseguito la ricerca nel database e l'integrazione degli errori peptidici, calcolare l'area di picco complessiva. Quindi, confrontalo con una curva standard esterna per stimare la concentrazione di peptidi nel digest FASP. Dopo aver stimato la quantità di peptidi, purificare una nuova aliquota del digest FASP corrispondente a due microgrammi di peptidi da due purificazioni consecutive dello stagetip come descritto qui.
La configurazione LC-MS utilizzata in questo protocollo si basa sull'iniezione diretta nella colonna analitica. Se si utilizza un sistema con una colonna di abbondanza, è possibile evitare il passaggio di purificazione C18 offline. Ricordarsi di utilizzare aghi e pistoni dedicati per ogni materiale cromatografico.
Dopo aver eluito i peptidi dalla punta dello stadio C18 con 10 microlitri di eluente, evaporare parzialmente l'eluito in una centrifuga sottovuoto per alcuni minuti, cercando di evitare la piena evaporazione. Quindi, aggiungere 47 microlitri dello 0,1% di acido formico e posizionare la soluzione risultante in una fiala HPLC per l'analisi LC-MS. Il sistema utilizzato qui si basa sul caricamento diretto dell'esempio di colonna senza utilizzare una colonna di abbondanza.
Le colonne analitiche sono realizzate internamente tirando un capillare ID da 75 micrometri dopo aver rimosso un pezzo di rivestimento in poliammide. La punta risultante può essere delicatamente sagomata con una fresa in ceramica. Il capillare viene quindi posto in una bomba di imballaggio e imballato con un liquame isopropanolo da 50 milligrammi per ml di C18 tre particelle di fase stazionaria di micrometri.
È necessaria una pressione del gas compresa tra 10 e 20 bar di azoto o elio. È possibile utilizzare colonne cromatografiche alternative o commerciali in esecuzione a flusso sub microliter al minuto. Assemblate la colonna su un pezzo a T.
Le altre due estremità sono collegate all'alimentazione ad alta tensione e al loop HPLC. Valutare la tensione di spruzzatura ottimale eseguendo il sistema a flusso isocratico. Quindi, inizia la tua analisi.
Separare i peptidi su un gradiente cromatografico lungo due ore come visualizzato. L'acquisizione dei dati consisterà in una rapida scansione completa del servizio MS seguita da 26 scansioni MS-MS su finestre precursori di larghezza variabile. A partire da 20 m/z di larghezza, per le prime 20 finestre che copriranno un intervallo m/z da 350 a 750 Thompson.
Quindi passare a una larghezza di 50 m/z per le cinque finestre seguenti e terminare con una singola scansione MS-MS, con una larghezza di isolamento di 200 Thompson. Larghezze più strette rappresentano una regione più popolata dello spettro in termini di presenza di precursori peptidici. Per l'analisi DIA sarà necessaria una libreria spettrale.
Per generare una libreria spettrale, è possibile eseguire alcuni esperimenti dipendenti dai dati sullo stesso sistema LC-MS-MS utilizzato per l'acquisizione di DIA utilizzando lo stesso gradiente cromatografico. Il frazionamento del campione aumenterà la copertura del proteoma. Le punte dello stadio possono essere utilizzate per il frazionamento del campione.
Un forte scambio dicationi e una fase inversa di base sono due valide alternative. Inizia con i 10 microgrammi di un pool di diversi digest FASP. Acidificare il campione utilizzando la concentrazione finale dello 0,2%TFA.
Caricare i peptidi su punte a stadio C18 ad alta capacità. Utilizzare più dischi in caso di elevate quantità di peptidi. Per 10 microgrammi di materiale, si consigliano due dischi.
Eseguire la purificazione C18 come descritto in precedenza. Preparare diverse fiale per la raccolta degli elui. Tanti quanti il numero di frazioni.
In questo caso 10 frazioni sono prodotte per eluizione graduale. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 20 microlitri del primo eluente. 0,2%idrossido di ammonio, 10 teab millimolare, 4% acetonitrile.
Dopo aver eluito completamente la prima frazione nel primo Eppendorf, spostare la punta dello stage sul flaconcino di raccolta successivo. Diluire in 20 passaggi di microlitri utilizzando come eluente, lo 0,2% di idrossido di ammonio, 10 teab millimolare e quindi aumentare la quantità di acetonitrile. Dopo aver frazionato l'esempio ed eseguono esperimenti dipendenti dai dati su ogni frazione, generare la libreria spettrale tramite la ricerca di database dei dati MS-MS.
La libreria verrà quindi importata in un software in grado di analisi dei dati DIA per la quantificazione delle proteine sulla base di un minimo di un peptide univoco assegnato da un minimo di tre transizioni. Aspettatevi di coprire una vasta gamma di proteoma urinario. Questa figura mostra l'identificazione e la quantificazione delle proteine in un intervallo di abbondanza, che si estende su cinque ordini di grandezza.
Il flusso di lavoro qui presentato combina il vantaggio di concentrazione e la versatilità del protocollo FASP con la sensibilità della modalità di scansione DIA. Questa combinazione fornisce una ricca mappa del proteoma urinario. Poiché la nostra configurazione di analisi non include l'uso di una colonna di abbondanza, il digest FASP è stato purificato sia dal forte scambio dicationi che dalle punte dello stadio in fase invertita.
Il passaggio Stage Tips in fase invertita può essere omesso quando una colonna di abbondanza è collegata direttamente alla colonna analitica. L'uso di questo flusso di lavoro è raccomandato per l'analisi di campioni di urina EPS, ma il suo uso può essere esteso alla proteomica urinaria in generale.
