Manca una piena comprensione del ruolo che le cellule M svolgono nell'omeostasi intestinale e nella difesa immunitaria, a causa della rarità delle cellule M nell'intestino. La differenziazione indotta delle cellule M nelle colture derivate da cellule staminali intestinali umane consentirà lo studio dello sviluppo e delle funzioni delle cellule M. Per rivestire le membrane Transwell, posizionare il numero desiderato di Transwell in una piastra di 24 pozza, creando un sistema a due camere.
Diluire la matrice extracellulare, o ECM, 25 volte in soluzione salina tamponata di fosfato sterile a freddo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione diluita a freddo in ogni camera superiore sulla membrana. Coprire la piastra del pozzo 24 con un coperchio e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius per due ore per consentire la solidificazione ECM sulla membrana.
Dopo due ore, rimuovere la piastra dall'incubatrice e posizionarsi in un cappuccio di coltura tissutale. Utilizzando pinzette sterili, invertire ogni Transwell per rimuovere delicatamente la soluzione rimanente. Lasciare asciugare le membrane all'aria nel cappuccio con il coperchio aperto mentre le cellule vengono raccolte.
Rimuovere la piastra degli enteroidi ileali dall'incubatore e rimuovere delicatamente il supporto di coltura da ogni pozzo per aspirazione sottovuoto o con una pipetta. Per rompere l'ECM, aggiungere 500 microlitri di EDTA ghiacciata da 0,5 millimolare ad ogni elemento contenente enteroidi ileali sospesi in ECM. Pipetta su e giù vigorosamente con un pipetter P1000 impostato su 500 microlitri per rompere ECM, rilasciando così enteroidi ileali nella soluzione.
Raccogliere la soluzione da ogni pozzo in tubi conici da 15 millilitri. Pellettare le cellule in una centrifuga a 140G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Il pellet dovrebbe essere visibile, ma può essere facilmente rimosso, quindi rimuovere lentamente il supernatante per aspirazione sottovuoto o con una pipetta.
Per digerire stretti collegamenti di giunzione e suddividere gli enteroidi ileali in singole cellule, rimescolare il pellet in 500 microlitri di tripside a temperatura ambiente ogni cinque pozzi raccolti. Utilizzando un pipetter P1000, pipettare su e giù per disaggregare i grumi. Incubare i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per cinque minuti o meno.
Aggiungere un millilitro di DMEM F-12 avanzato con 10%FPS per 500 microlitri di tripina per inattivare la tripina. Pipetta su e giù con un P1000 impostato su 500 microlitri almeno 50 volte contro il lato del tubo conico per disaggregare ulteriormente i grumi rimanenti in singole celle. Posizionare un colino a celle da 40 micron su un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere un millilitro di DMEM F-12 avanzato con 10%FPS per bagnare il filtro cellulare.
Pipettare la sospensione a cella singola dal conico da 15 millilitri sul colino. Lavare il colino con un millilitro di DMEM F-12 avanzato con 10%FPS. Trasferire le cellule che hanno attraversato il filtro cellulare dal tubo conico da 50 millilitri in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Contare le cellule usando un emocitometro. Centrifugare le cellule nel nuovo tubo da 15 millilitri a 400G per cinque minuti a temperatura ambiente. Il pellet di cellule dovrebbe essere visibile.
Rimuovere con cura il supernatante con una pipetta, salvando nuovamente il supernatante nel caso in cui il pellet si sblocchi. Resuspend il pellet cellulare in MCMGF plus con 10 micromolare Y27632. Assicurarsi che le membrane codificate ECM si siano completamente asciugate come valutato dall'occhio.
Lavare la camera superiore con 200 microlitri di MCMGF plus. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione cellulare in ogni camera superiore. Aggiungere 700 microlitri di MCMGF plus con 10 micromolari Y27632 ad ogni camera inferiore.
Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale di 37 gradi Celsius con il 5%CO2. Dopo un giorno di crescita, rimuovere il supporto dalla camera superiore e sostituirlo con 200 microlitri di MCMGF fresco plus per prevenire la crescita di più strati cellulari. Una volta che i monostrati sono circa l'80% confluenti, di solito tra i giorni da uno a tre post seeding, sostituire i mezzi basilaterali con mezzi di differenziazione per i pozzi di controllo o con mezzi cellulari M per pozzi di induzione cellulare M.
Sostituire il supporto nella camera superiore con mezzi di differenziazione per entrambe le condizioni. Per verificare la differenziazione delle celle M mediante QRTPCR, rimuovere innanzitutto il supporto dalle camere superiore e inferiore. Lavare delicatamente la camera superiore due volte con 300 microlitri di PPS a temperatura ambiente.
Aggiungere 300 microlitri di TRIzol a ogni camera superiore e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Nel frattempo, etichettare i tubi di micro centrifuga per ogni pozzo e aggiungere 700 microlitri di TRIzol a ciascun tubo. Raccogliere l'omogeneato cellulare tubazione delicatamente su e giù tre volte con un P1000 e trasferire il contenuto in corrispondenti tubi di microfuga.
Vortice per cinque secondi da mescolare. Conservare i campioni a temperatura ambiente per altri tre minuti, quindi continuare con i protocolli QRTPCR standard o archiviare i campioni a -80 gradi Celsius. Per verificare la differenziazione delle cellule M mediante immunofluorescenza, in primo luogo, rimuovere il supporto dalla camera superiore.
Lavare delicatamente due volte con 300 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri a temperatura ambiente 4%PFA in PBS alla camera superiore. Coprire la piastra con un foglio e lasciare riposare per 25 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver rimosso il PFA, lavare la camera superiore tre volte con 300 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Incubare i monostrati con 100 microlitri di 5%BSA sciolti in PBS per 30 minuti al buio a temperatura ambiente per bloccare i monostrati prima di rimuovere la soluzione. Preparare la soluzione di anticorpi primari GP2 in BSA all'uno per cento in PBS con una diluizione da uno a 100 e aggiungere 100 microlitri per pozzo.
Macchiare per un'ora a temperatura ambiente al buio, prima di rimuovere la soluzione. Lavare la camera superiore tre volte con 300 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Preparare una soluzione di macchia secondaria di phalloidina IgG di capra con tag fluorescente e DAPI e aggiungere 100 microlitri per pozzo.
Macchiare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBS. Quindi, posizionare una goccia di cinque microliter di soluzione di montaggio su uno scivolo di vetro.
Rimuovere il pozzo dalla piastra del pozzo 24 e invertire. Durante la rimozione della membrana dal Transwell, la membrana deve rimanere completamente piatta. I dossi nella membrana impediscono una tenuta ferma allo scivolo di vetro e possono influire notevolmente sulla qualità dell'immagine.
Per garantire il successo, tagliare accuratamente la membrana dal pozzo usando un bisturi affilato. Posizionare la membrana con le celle rivolte verso l'alto sulla goccia della soluzione di montaggio sullo scivolo di vetro. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di montaggio sulla parte superiore e centrale della membrana e posizionare uno scivolo di copertura sulla parte superiore per sigillare la membrana tra lo scivolo di vetro e lo scivolo di copertura.
Asciugare gli scivoli a temperatura ambiente al buio per 24 ore. Le cellule M sono rilevate dall'espressione superficiale di GP2 da immunofluorescenti. Tipicamente, in un monostrato confluente, si osservano da una a cinque cellule M in un dato campo del microscopio con ingrandimento 40X entro i giorni da sei a otto post seeding in campioni trattati con RANKL e TNF alpha.
Nei campioni non trattati non viene vista alcuna espressione GP2. La vista ortogonale del piano XZ sovrapposta a una sonda di falloidina mostra strutture actina che circondano ogni cellula, ed espressione GP2 sulla superficie apicale delle cellule M. Questo modello riassume la bassa frequenza delle cellule M presenti nell'intestino umano.
Per determinare se le cellule M sviluppate in questo modello sono in grado di legarsi all'IgA, la presenza di IgA sulle cellule M viene visualizzato utilizzando un anticorpo secondario coniugato a fluoro che riconosce la catena pesante del siero umano IgA. Le cellule M trattate con IgA per un'ora hanno IgA legato alla superficie apicale, mentre le cellule M nei pozzi di controllo che sono state trattate solo con l'anticorpo secondario dell'IgA, non hanno un segnale rilevabile. Inoltre, L'IgA si lega specificamente alla superficie apicali delle cellule M e non si trova legato ad alcuna cellule priva di macchia superficiale GP2.
Inoltre, le cellule M hanno actina densa tipicamente più corta sulla loro superficie apicale. Passare ai mezzi di differenziazione integrati con RANKL TNF alpha quando i monostrati sono circa l'80% confluenti, è fondamentale per ottenere una buona differenziazione cellulare M. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di esplorare le domande relative allo sviluppo delle cellule M, nonché le interazioni con agenti patogeni ospiti e gli studi sul trasporto di farmaci che coinvolgono cellule M.
