Questo protocollo descrive l'istituzione di un nuovo modello di topo per studiare il fungo della pelle, Malassezia, e la sua interazione con la pelle di mammifero in vivo. A differenza degli approcci in vitro, questo modello di infezione consente lo studio di meccanismi immunitari innati e adattivi contro Malassezia in tutta complessità e in modo specifico per i tessuti. La malassezia è associata a vari disturbi della pelle, come la dermatite atopica.
Comprendere la risposta immunitaria al fungo può fornire nuove strategie per trattare malattie infiammatorie della pelle così frequenti e croniche. L'infezione cutanea sperimentale con Malassezia fornisce un modello tanto atteso per studiare come i funghi commenali della pelle modulano il sistema immunitario e quindi hanno un impatto sul decorso e sulla gravità di vari disturbi della pelle. Per preparare un inoculo di Malassezia aggiungere 10 millilitri di mezzo liquido mDixon e da tre a cinque colonie individuali di Malassezia da una piastra di agar mDixon a un pallone sterile da 100 millilitri Erlenmeyer.
Quindi posizionare il pallone a 30 gradi Celsius e 180 rotazioni al minuto per 48-96 ore. Quando la coltura è color crema e torbida, trasferire due millilitri della coltura in un tubo sterile a microcentrifugo a due millilitri e sedimentare il lievito mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in un millilitro di PBS per una seconda centrifugazione seguita da resuspensione in un millilitro di PBS fresco con pipettazione vigorosa.
Diluire la sospensione Malassezia da 20 a 50 volte con PBS per garantire che la lettura sia compresa tra 0,1 e una e misurare l'OD 600 su uno spettrometro. Aliquota un volume della sospensione di Malassezia in PBS che corrisponde ad un OD 600 di quattro in un tubo sterile da due millilitri per animale da infettare e sedimentare il lievito per centrifugazione. Quindi rimospendato i pellet in 200 microlitri di olio d'oliva autoctono.
Per iniziare un'infezione da Malassezia, confermare la mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo C57 Black6 femmina di sei-otto settimane anestetizzato e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Utilizzare una pinza per misurare lo spessore di due diverse aree di entrambe le orecchie per consentire il calcolo dello spessore medio per orecchio. Quindi applicare un piccolo pezzo di nastro adesivo sulla pelle di un orecchio prima di rimuovere rapidamente il nastro dalla pelle dell'orecchio cinque volte utilizzando ogni volta un nuovo pezzo di nastro adesivo.
Dopo lo stripping, utilizzare una pipetta sterile per applicare 100 microlitri della sospensione dell'olio d'oliva Malassezia sul lato dorsale di ogni orecchio e iniettare 200 microlitri di soluzione sterile e prebellita del glucosio del 2% sottocutaneamente nella piega nucale per sostenere il metabolismo e la reidratazione. Quindi consentire al mouse di riprendersi su una pastiglia riscaldante per 30 minuti con il monitoraggio prima di riportare l'animale nella sua gabbia. Nei punti di tempo sperimentali appropriati, utilizzare una pinza per misurare due aree diverse di ogni orecchio del mouse per consentire il calcolo dello spessore medio per orecchio.
Per misurare il carico fungino nella pelle infetta, aggiungere 500 microlitri di sterile 0,05%NP40 in acqua distillata e una sfera d'acciaio autoclavata da cinque millilitri di diametro a un tubo microcentrifugo a due millilitri per orecchio e pesare ogni tubo su un bilanciere. Successivamente, raccogliere le orecchie da ogni animale alla base e posizionare i tessuti in singoli tubi di NP40. Pesare ogni tubo sulla bilancia per determinare il peso di ogni campione dell'orecchio prima di omogeneizzare i tessuti dell'orecchio per sei minuti a 25 Hertz.
Quindi distribuire 100 microlitri di ogni campione su piastre di agar mDixon e distribuire le sospensioni in modo omogeneo attraverso l'agar prima della loro incubazione capovolta a 30 gradi Celsius. Qui vengono mostrate immagini rappresentative per la crescita di Malassezia sympodialis nel mezzo liquido mDixon e sull'agar mDixon come dimostrato. Un aumento dello spessore dell'orecchio può essere osservato dopo l'applicazione di furfur Malassezia sulla pelle che è stata interrotta dalla barriera rispetto alla pelle imperturbabile dei topi selvatici di tipo C57 Black6.
Infatti, la quantificazione dell'aumento dello spessore dell'orecchio nel tempo rivela che il cambiamento di spessore è significativo rispetto alla pelle trattata con veicolo. Inoltre, il carico fungino nella pelle dell'orecchio il secondo giorno dopo l'infezione da Malassezia pachydermatis è da 100 a 1000 volte superiore al limite di rilevamento. Malassezia tende a formare aggregati e non è facilmente sospendibile.
Pertanto, garantire l'omogeneizzazione della sospensione del fungo dell'olio mediante un ampio vortice. Ulteriori letture possono includere, istologia per determinare la patologia della pelle e l'isolamento delle cellule immunitarie dalla pelle e linfonodi drenante per indagare la risposta immunitaria antimicotica. Questo modello apre l'opportunità di studiare la risposta immunitaria contro Malassezia e di indagare il ruolo del fungo come commensal nel contesto di vari disturbi della pelle.
Le specie di malassezia sono classificate come organismi BSL-2 in alcuni paesi. Assicurati di seguire la regolamentazione delle tue autorità locali e di utilizzare le misure di sicurezza appropriate.
