Questo metodo consente alla struttura cellulare e alla funzione di essere perturbate attraverso la fusione di due diversi tipi di cellule per affrontare domande come come le cellule rispondono ai cambiamenti nel numero di organelli. Imaging di proteine contrassegnate fluorescentmente all'interno di cellule fuse, le strutture cellulari possono essere referenziate al loro tipo di origine cellulare per studiare i meccanismi dell'omeostasi e della funzione degli organelli. Per l'etichettatura fluorescente dei coloranti, vedere le popolazioni di cellule tumorali umane di interesse in modo tale che ogni coltura si sia espansa ad almeno sei volte 10 alla sesta cella con una confluenza dal 70 al 90% entro la mattina successiva.
Il giorno dell'etichettatura, lavare le cellule rootletin eGFP e rootletin-mScarlet due volte con 10 millilitri di PBS per lavaggio. Diluire il colorante a cellule viola a 500 nanomolari nel colorante PBS e far red cell a 200 nanomolari in PBS. Etichettare le cellule rootletin eGFP con il colorante a cellule violette diluito e le cellule rootletin-mScarlet con il colorante diluito a celle far red per un minuto a temperatura ambiente.
Alla fine delle incubazioni, interrompere le reazioni con 10 millilitri di DMEM per cinque minuti. Lavare sia colture cellulari etichettate che una coltura cellulare parentale senza etichetta con 10 millilitri di PBS fresco prima di incubare tutte le colture con un millilitro di triptamina prebellica. Al termine dell'incubazione, trasferire le soluzioni cellulari staccate su singoli tubi conici da 15 millilitri per la centrifugazione e rimorsi delicatamente i pellet etichettati coloranti in un millilitro di PBS e le celle non etichettate in un millilitro di DMEM.
Quindi restituire tutti i campioni di cellule all'incubatore di coltura cellulare. Per l'esperimento di fusione cellulare, mescolare 500 microlitri di cellule etichettate coloranti Violet con 500 microlitri di celle etichettate coloranti Far Red in un nuovo tubo da 15 millilitri e sedimentare le restanti cellule etichettate non miscelate per centrifugazione. Resuspend i pellet in un millilitro di DMEM fresco e riposizionare le cellule nell'incubatrice.
Raccogliere le cellule miste per centrifugazione e aggiungere 700 microlitri del 50%1450 PEG in modo drop-wise al pellet per un periodo di 30 secondi. Dopo 3,5 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 10 millilitri di DMEM senza siero per un periodo di 30 secondi e posizionare i tubi nell'incubatrice per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, sedimentare le cellule miste mediante centrifugazione e rimorsi delicatamente il pellet in un millilitro di mezzo completo.
Per arricchire per la popolazione cellulare fusa da FACS, filtrare delicatamente tutte le cellule in singoli tubi FACS attraverso un colino da 70 micrometri e creare grafici di discriminazione di dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale e al farsesco nel software del citometro. Eseguire le celle senza etichetta per registrare la loro intensità di fluorescenza e creare porte per identificare le celle fuse. Successivamente, esegui le singole cellule etichettate violette positive per confermare che non c'è fuoriuscita di segnale Violet nel canale Far Red e le singole cellule etichettate di colorante Far Red positive per confermare che non c'è alcun segnale Far Red nel canale Violet.
Quindi eseguire brevemente il campione di fusione per confermare che le celle fuse sono visibili con questi cancelli. Una volta impostati i parametri di smistamento, allineare centralmente il flusso di smistamento in un piatto di imaging a otto pozzi contenente 100 microlitri di mezzo di crescita e ordinare le doppie cellule fuse positive direttamente nel piatto. Quando tutte le cellule sono state ordinate, posizionare immediatamente il piatto nell'incubatore di coltura cellulare per due o 16 ore.
Per la colorazione immunofluorescente, sostituire prima il supernatante di coltura cellulare con 200 microlitri del 4% di paraformaldeide per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS per lavaggio prima di permeabilizzare le cellule in 200 microlitri dello 0,1% di tensioattivo non ionico per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, bloccare il legame non specifico con 200 microlitri di albumina sierice bovina al 3% in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente seguita dall'etichettatura con gli anticorpi di interesse in 150 microlitri di tampone di colorazione.
Dopo un'ora a temperatura ambiente, lavare le celle due volte in 300 microlitri di PBS per cinque minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il lavaggio con 200 microlitri di PBS fresco. Per acquisire immagini delle celle fuse, utilizzare un microscopio a fluorescenza appropriato in grado di immagini a quattro colori e raccogliere immagini tridimensionali.
Le cellule opportunamente etichettate sono visibili durante la citometria del flusso tramite segnale fluorescente ad un livello superiore rispetto alle celle di controllo non etichettate. I cancelli possono essere impostati per lo smistamento per arricchire per la doppia popolazione cellulare positiva direttamente in piatti di imaging per ulteriori analisi microscopiche. La fusione induce un importante riarrangiamento dell'architettura cellulare attraverso la miscelazione di due cellule in una sola.
Gli eterokaryon sono identificati come cellule contenenti entrambi i segnali di colorante fluorescenti mescolati all'interno di una singola cellula senza intervenire su membrane plasmatiche. Inoltre, due nuclei possono anche essere visibili nelle celle fuse mediante imaging Brightfield. La struttura e la funzione cellulare possono essere ulteriormente studiate attraverso la fusione di cellule contenenti meGFP e mScarlet proteine taggate.
La fusione si traduce in un raddoppio del numero baricentro all'interno di eterokaryons visibili come almeno quattro focolai di materiale pericentrilare quando il componente pericentrilare centrosomalo NEDD1 è contrassegnato fluorescentmente. La fusione di cellule con rootletina taggata endogenamente fluorescentmente consente di identificare la cellula di origine di ciascun centrosoma in un eterocarione. Questo protocollo dimostra come fondere linee cellulari etichettate in modo differenziato e come immagini i loro organelli per comprenderne la struttura e la funzione.
Questo robusto protocollo è sia relativamente facile che relativamente economico da eseguire rispetto a metodi simili. Questa tecnica può essere usata per porre una serie di domande come come è regolata la fusione degli organelli e come le cellule rispondono ai cambiamenti nel numero di organelli subcellulari.
