Questo lavoro è finanziato dalla CBS Bridging Grant assegnata a OOM. OOM, PAA e AS hanno progettato lo studio ed eseguito gli esperimenti. AS e PAA hanno analizzato i risultati. OOM e PAA hanno preparato il manoscritto. Ringraziamo il Dr. Karl Disseroth (Stanford University) per aver reso l'AAV disponibile per il nostro uso.

Tutte le procedure sperimentali e di manipolazione degli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Animale da esperimento
<ol><li>Utilizzare topi di 5-6 settimane.</li>
	<li>Ospitare 3-5 animali per gabbia in condizioni standard di 12 ore alternando luce e buio. Cibo e acqua dovrebbero essere forniti ad libitum.</li>
</ol>2. Craniotomia e preparazione animale
NOTA: Questa sezione descrive le procedure pre- e peri-operatorie per la craniotomia del topo. Utilizzare apparecchi stereotassica standard e coordinate appropriate (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML e Dorsoventral: DV). Fare riferimento a un atlante del cervello del topo per determinare le coordinate per la regione del cervello di interesse.
<ol><li>Anestetizzare i topi mediante iniezione di cocktail intraperitoneale ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg). Eseguire un test del pizzico della dita del piede per garantire l'assenza di sensazione prima dell'inizio dell'intervento chirurgico. NOTA: In alternativa, l'anestesia isoflurano con una camera nasale appropriata può essere utilizzata anche per questo passaggio.</li>
	<li>Fissare delicatamente la testa dell'animale sull'apparato stereotassico. NOTA: è importante maneggiare gli animali con cautela durante questo processo. Inoltre, controllare la frequenza respiratoria e altri elementi vitali prima di procedere con l'intervento chirurgico. Lasciare riposare l'animale per ~ 7 minuti per ridurre lo stress.<ol>
<li>Posizionare una piastra riscaldante sul telaio stereotassico in modo tale che il corpo dell'animale sia sdraiato su di esso. Ciò contribuirà a mantenere la temperatura corporea e mantenere l'animale caldo durante la procedura. Conservare la piastra riscaldante per la cura e il recupero postoperatorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare un clipper per rimuovere i peli sul cuoio capelluto e pulire la pelle con una soluzione di iodio.<ol>
<li>Applicare lidocaina topica per bloccare la sensazione sul cuoio capelluto.</li>
		<li>Utilizzare un bisturi per fare un'incisione del cuoio capelluto della linea mediana che si estende dalla regione frontale a quella occipitale.</li>
		<li>Pulire l'area di incisione con soluzione di iodio, quindi esporre la calvaria. NOTA: Una piccola quantità di soluzione di perossido di idrogeno al 3% può essere applicata per rimuovere il periosteo dalla calvaria. Ciò aumenterà la visibilità dei punti di riferimento (bregma e lambda) e delle suture.</li>
		<li>Utilizzando un atlante stereotassico cerebrale di topo, determinare le coordinate AP e ML relative al bregma.</li>
		<li>Per l'iniezione di VTA, posizionare una siringa ad ago a punta smussata ultrafine (ad es. Siringa Neuros) alle coordinate AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm rispetto al bregma.</li>
		<li>Utilizzare uno strumento di perforazione per praticare un foro di 1 mm (craniotomia) nel cranio alla coordinata AP/ML contrassegnata. NOTA: questo passaggio richiede un livello significativo di cautela. Una pressione minima deve essere applicata durante la perforazione per evitare che la punta del trapano schiacci il tessuto cerebrale. Nel presente studio, la punta del trapano era di 0,8 mm e la velocità del trapano era impostata a 15.000 giri / min. ATTENZIONE: Se il perossido di idrogeno è stato utilizzato nella pulizia dell'incisione o della calvaria, garantire la rimozione totale della soluzione o consentire la completa secchezza prima della perforazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Iniezione di cocktail AAV
NOTA: Questa sezione descrive il processo di iniezione di AAV nel VTA di topi adulti C57BL/6 (23-27 g). Il metodo descritto può essere utilizzato per l'iniezione di AAV in qualsiasi regione del cervello utilizzando apparecchi stereotassica standard e coordinate appropriate. Per dimostrare questo protocollo, eYFP e hChR2 sono stati espressi nei neuroni del glutammato VTA utilizzando la trasfezione mediata da AAV5 sotto un promotore CaMKIIα (Figura 1). La ricombinazione Cre-lox può essere utilizzata anche per questo passaggio.
<ol><li>Montare una siringa con ago a punta smussata ultrafine (32 G; capacità di 5 μL con precisione di 100 nL) su un iniettore. Fissare il supporto della siringa su un micromanipolatore. NOTA: per questa procedura è stato utilizzato un supporto per siringa manuale, con calibrazione da 1,6 nL. È inoltre possibile utilizzare un iniettore automatico.</li>
	<li>Riempire la siringa con acqua a doppio distillato per pulire e testare il flusso del fluido.</li>
	<li>Aliquote di disgelo del cocktail AAV (sierotipo 5) su ghiaccio. Gli AAV sono meglio conservati a -80 °C per mantenere il titolo virale per una buona espressione.</li>
	<li>Riempire la siringa montata con 1.000 nL di soluzione AAV (10 mM in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4). Erogare 10 nL della soluzione AAV per confermare il flusso del liquido prima di abbassare l'ago in un sito di iniezione.</li>
	<li>Utilizzare un micromanipolatore per abbassare l'ago stereotassicamente nella profondità desiderata (coordinata DV). Dopo aver abbassato l'ago alla profondità desiderata, lasciare che la siringa rimanga in posizione per 10 minuti prima dell'iniezione. NOTA: Per questa procedura, l'ago è stato abbassato nel VTA ad una profondità (DV) di 4,5 mm dalla superficie piale del cervello. Per altre aree del cervello, utilizzare la coordinata dorsoventrale appropriata (fare riferimento all'atlante del cervello del topo).</li>
	<li>Iniettare 600-800 nL di AAV nel VTA. Il volume dell'iniezione può essere regolato in base alle dimensioni del sito target.<ol>
<li>Fornire la soluzione AAV alla velocità di 60 nL/min (intervallo di 3 min).</li>
		<li>Per esprimere eYFP e hChR2 nei neuroni e nelle proiezioni del glutammato VTA, iniettare AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP. NOTA: il metodo di ricombinazione Cre-lox può essere utilizzato anche a seconda dell'obiettivo dell'esperimento.</li>
		<li>Lasciare che l'ago rimanga in posizione per 15 minuti dopo l'iniezione di AAV. Ciò ridurrà la diffusione e il riflusso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prelevare l'ago della siringa e quindi suturare l'incisione per chiudere la ferita.</li>
	<li>Somministrare antibiotici e analgesia come parte delle cure post-operatorie. Posiziona il mouse su una calda piattaforma imbottita e monitora l'animale fino a quando non è sveglio. NOTA: Dopo 3 settimane di iniezione, l'espressione di AAV può essere osservata mediante il rilevamento a fluorescenza della proteina reporter (eYFP) nelle sezioni cerebrali del topo. Inoltre, gli esperimenti di fotostimolazione possono essere eseguiti dopo 3 settimane (Figura 2).</li>
</ol>4. Configurazione per registrazioni neurali in vivo con optogenetica
NOTA: Questa sezione descrive i passaggi per la registrazione neurale acuta con il tracciamento optogenetico di un circuito cerebrale (proiezione del neurone glutammato VTA al CA1). Se necessario, controllare il sistema (amplificatore e connessioni) per problemi di rumore elettrico e messa a terra prima di iniziare questo passaggio. L'esecuzione di questo passaggio in una gabbia di Faraday può aiutare a eliminare il rumore elettrico nella registrazione.
<ol><li>A 3 settimane dopo l'iniezione di AAV, anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di uretano (0,2 mg/kg). ATTENZIONE: L'uretano è cancerogeno e deve essere maneggiato con cautela mentre si indossano indumenti protettivi. Inoltre, la somministrazione di anestesia con uretano a questa concentrazione non è sopravvivenza.</li>
	<li>Apporre la testa dell'animale su un telaio stereotassico come descritto in precedenza (passo 2.2, Figura 3A). Eseguire una craniotomia per esporre la dura (Figura 3A). Utilizzare uno strumento di foratura (dimensione della punta: 0,8 mm, velocità: 15.000 giri / min) per rimuovere parte dell'osso parietale.<ol>
<li>La craniotomia dovrebbe essere larga circa 3 mm x 4 mm. Applicare gocce di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) su quest'area per prevenire la secchezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sotto un microscopio di dissezione (digitale), utilizzare una punta dell'ago piegata (27 G) per asportare la dura esposta. Fare attenzione a non separare la delicata copertura piale e i tessuti corticali in quest'area.</li>
	<li>Forare un foro nell'osso occipitale (dimensione della punta: 0,8 mm, velocità: 10.000 giri / min) per tenere la vite di terra (vite Phillips a testa di padella; M0,6 x 2,0 mm).</li>
	<li>Collegare un filo di terra in acciaio inossidabile. NOTA: è possibile utilizzare anche altri tipi di fili (Figura 3b).</li>
	<li>Per la fotostimolazione combinata (VTA) e la registrazione neurale (CA1), utilizzare un apparecchio stereotassico multi-rail dotato di micromanipolatori ultra-fini (10 μm o 1 μm). Montare la fibra ottica e la sonda neurale di registrazione rispettivamente su micromanipolatori da 10 μm e 1 μm.<ol>
<li>Se necessario, utilizzare un adattatore per sonda di testa (Figura 3c). NOTA: Nel protocollo attuale, uno stadio principale a 32 canali era dotato di un adattatore per contenere un elettrodo di registrazione a 4 canali (Figura 3d). Il filo di terra in acciaio inossidabile è stato saldato alla porta di collegamento a terra dell'adattatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alle coordinate AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, abbassare la fibra ottica di 400 μm di diametro nel VTA.<ol>
<li>Prima di abbassare la fibra ottica, collegare la ghiera a un cavo in fibra ottica (con ghiera in acciaio inossidabile o ceramica) collegato a una sorgente LED accoppiata a fibre. NOTA: assicurarsi che l'intensità della luce e la messa a fuoco siano impostate come desiderato. La scelta della sorgente luminosa a LED dovrebbe corrispondere alle opsin prese di mira. Qui, un driver LED a 470 nm (luce blu) è stato utilizzato per la fotoattivazione hChR2 (Figura 4a).</li>
		<li>Per sincronizzare l'impulso luminoso con la registrazione neurale, collegare il driver LED e la porta IN digitale del controller di registrazione a un pulsatore TTL (Transistor-Transistor Logic) (Figura 4b). Questo può essere ottenuto utilizzando uno splitter BNC. NOTA: l'uso di un pulsatore TTL offre la flessibilità di impostare digitalmente la frequenza e la durata del treno di impulsi desiderate. Nel protocollo attuale, gli impulsi luminosi da 10 ms sono stati attivati a 50 Hz18. Per il controllo TTL del driver LED, commutare il driver su "trigger". In questa modalità, l'intensità della luce può essere regolata ruotando la "manopola". La frequenza di stimolazione può essere regolata per adattarsi alle variabili sperimentali e potrebbe variare da 1 a 100 Hz. Per il tracciamento del circuito neurale, si raccomanda una frequenza di stimolazione di >20 Hz.</li>
		<li>Regolare la manopola per determinare l'intensità effettiva che può generare una risposta senza produrre artefatti fotoelettrici. Se necessario, riposizionare la fibra ottica per eliminare gli artefatti19. NOTA: il driver LED utilizzato per il protocollo corrente produce una potenza luminosa di ~21,8 mW.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Registrazione neurale
<ol><li>Utilizzare una sonda neurale acuta con un gambo spesso 15-50 μm, che misura almeno 5 mm di lunghezza. NOTA: la registrazione da strutture cerebrali profonde richiederà sonde neurali con un gambo più lungo. Nel presente studio è stata utilizzata una sonda con una lunghezza del gambo di 20 mm.</li>
	<li>Collegare lo stadio della testa del preamplificatore al controller di registrazione tramite un cavo SPI (Serial Peripheral Interface). Controllare l'illuminazione a colori dei LED sulle porte del controller di registrazione. I LED verdi e gialli indicano la tensione corretta sulla scheda amplificatore collegata. Il LED rosso indica un controllo dello stadio della testa del software funzionante (Figura 5b).</li>
	<li>Utilizzando un micropolatore, posizionare i siti di contatto dell'elettrodo nello strato di cella piramidale del CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: da +1,1 a 1,2 mm). NOTA: la fibra ottica e l'elettrodo possono essere posizionati in altre regioni cerebrali desiderate per la fotostimolazione e la registrazione.</li>
</ol>6. Impostazioni dell'amplificatore e del filtro
<ol><li>Collegare il sistema di amplificazione del controller di registrazione a un computer tramite una porta USB 3.0. Collegare lo stadio principale all'amplificatore utilizzando il cavo SPI. Avviare il software del controller. Se non collegato correttamente, il sistema visualizzerà un messaggio "dispositivo non trovato".</li>
	<li>Fare clic su Esegui per visualizzare l'attività sui canali. Ogni forma d'onda viene tracciata come tensione (asse y) rispetto al tempo (asse x). A seconda della regione di interesse, regolare la tensione e le scale temporali per regolare la visualizzazione della forma d'onda.</li>
	<li>Se sono attivi solo pochi canali, disabilitare i canali inutilizzati per ridurre le dimensioni del file sul disco di archiviazione.</li>
	<li>Impostare la frequenza di campionamento e le frequenze di taglio modificando i parametri della larghezza di banda sul software di acquisizione. Per la registrazione a singola unità, impostare le frequenze di taglio superiore e inferiore rispettivamente su 300 Hz e 5.000 Hz. Modificare la frequenza di campionamento dell'amplificatore a 30 kS/s. NOTA: la scelta di una frequenza di campionamento elevata produrrà una dimensione del file maggiore.</li>
	<li>Prima di registrare, controllare l'integrità dei canali dell'elettrodo misurando l'impedenza a 1.000 Hz. Questo può essere fatto avviando la funzione nell'interfaccia utente (software del controller). Un canale di lavoro dovrebbe avere un valore di impedenza compreso tra 0,1 e 5 MΩ.</li>
	<li>Se un'uscita audio (altoparlante) è collegata alla porta ANALOG OUT, regolare il guadagno e il silenziatore per un suono di picco ottimale.</li>
	<li>Per visualizzare il marcatore del treno di impulsi TTL nella registrazione del picco, abilitare la visualizzazione per il marcatore DIGITAL IN. Per registrare il timestamp del treno di impulsi, abilitare la visualizzazione del canale DIGITAL IN prima dell'esperimento principale. NOTA: di solito c'è più di un canale "DIGITAL IN" (1 o 2). Assicurarsi che il cavo BNC dell'pulsatore TTL sia collegato alla porta "DIGITAL IN" selezionata per la visualizzazione nel software del controller di registrazione.</li>
	<li>Per la visualizzazione in tempo reale della forma d'onda spike, aprire la finestra spike scope e impostare la soglia con il clic del mouse.</li>
	<li>Ispezionare il livello di rumore monitorando il Root Mean Square (RMS in μV). Per la registrazione pulita del picco, è preferibile che la soglia del picco neurale sia almeno 5x RMS.</li>
	<li>Una volta completata l'installazione, selezionare il formato di output del file. NOTA: Qui, il picco neurale CA1 è stato registrato in formato .rhd. Altri formati di file (.rhs e .dat) possono anche essere selezionati per corrispondere ai formati di file consentiti dal software di analisi.</li>
</ol>7. Registrazione e impostazioni optogenetiche in vivo
<ol><li>Aprire il software di controllo degli impulsi (TTL) che visualizza vari parametri di impulso regolabili. Selezionare la porta COM appropriata sul software. Impostare i parametri dell'impulso regolando le impostazioni Treno e Gruppo. NOTA: la condizione dell'impulso deve essere determinata considerando le variabili sperimentali e il design.</li>
	<li>Nel software del controller dell'amplificatore, fare clic su Esegui per rilevare i picchi neurali nell'ippocampo o nell'area cerebrale desiderata. Se necessario, regolare la profondità dell'elettrodo per rilevare i neuroni vitali e attivi.</li>
	<li>Una volta rilevata l'attività di tensione extracellulare, osservare i picchi basali per 15 minuti e monitorare i parametri vitali dell'animale. Inoltre, testare l'impulso luminoso per rilevare i neuroni reattivi all'interno del CA1 o della regione bersaglio anatomica desiderata. NOTA: verificare la disponibilità di artefatti fotoelettrici ed eliminarli regolando l'intensità della luce o la posizione della fibra ottica.</li>
	<li>Registrare l'attività di base per ~ 10 minuti prima di attivare l'impulso luminoso alla frequenza desiderata (Figura 5a,b). Ciò consentirà il confronto delle velocità di sparo o scoppio con e senza illuminazione. NOTA: Nel presente studio, l'attività di base è stata registrata per 10 minuti senza illuminazione, seguita dall'illuminazione a 50 Hz (Filmato 1).</li>
</ol>8. Analisi
<ol><li>Converti il file .rhd nel formato di outputNex 5.</li>
	<li>Nome file di processo. Nex5 in un software di smistamento offline per rilevare treni raster e forme d'onda a singola unità (Figura 5a–b).<ol>
<li>Selezionare il canale desiderato dalla finestra a discesa. NOTA: i dati di picco registrati continuamente possono essere visualizzati in una finestra separata dell'OFSS. Anche la scala temporale può essere regolata. Se viene utilizzato un tetrodo, l'OFSS può essere impostato per ordinare i 4 canali come tetrodo.</li>
		<li>Impostare il livello di tensione per l'estrazione della forma d'onda di attraversamento della soglia. ATTENZIONE: utilizzare un minimo di 5 RMS per il corretto rilevamento dei picchi.</li>
		<li>Rileva le forme d'onda, quindi esegui lo smistamento dei picchi utilizzando il metodo di ricerca della valle (automatico) o K-means (semiautomatico). Se necessario, unire unità che occupano regioni simili dello spazio PCA (3D-Principal Component Analysis).</li>
		<li>Esporta ordinato . Nex5 per ulteriori analisi (Figura 5c–d). NOTA: i risultati dell'analisi per l'intervallo interspike, la velocità di sparo e la velocità di scoppio possono essere esportati in altre piattaforme di analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Rilevazione della fluorescenza dell'espressione di AAV
<ol><li>Dopo la registrazione, eutanasizzare l'animale in una camera isoflurano.</li>
	<li>Eseguire la perfusione transcardica con PBS 10 mM (~10 mL), seguita da paraformaldeide tamponata con fosfato al 4% (PB-PFA, ~10 mL).</li>
	<li>Rimuovere l'intero cervello intatto e fissarlo in PB-PFA al 4% per 48 ore.</li>
	<li>Trasferire il cervello fisso in PB-PFA al 4% contenente il 30% di saccarosio per la crioconservazione a 4 °C. Dopo 72 ore, sezionare il cervello in un criostato e montare le fette su un vetrino rivestito di gelatina. NOTA: Nel protocollo attuale, le sezioni contenenti la parte chiusa dell'ippocampo (rostrale) sono state selezionate per dimostrare i terminali etichettati AAV nel DG, CA3 e CA1.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).</li><li>Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-synaptic+Neural+Circuit-Tracing+with+Neurotropic+Viruses.">Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses.</a> Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).</li><li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+as+transneuronal+tracers.">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Dragatsis, I., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+generation+of+conditional+gene+repair+mutations+in+mice.">A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice.</a> Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141 (1), 154-165 (2010).</li><li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior.">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Kohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genetic+and+optogenetic+tools+reveal+hippocampal+CA2+circuits.">Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).</li><li>Gombash, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vector+Delivery+to+the+Enteric+Nervous+System:+A+Review.">Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review.</a> Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vectors+in+Neuroscience+Research.">Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Montardy, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+glutamatergic+VTA+neural+population+responses+to+aversive+and+rewarding+conditioning+in+freely-moving+mice.">Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice.</a> Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+vector:+use+for+transgene+expression+and+anterograde+tract+tracing+in+the+CNS.">Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS.</a> Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+anterograde+transsynaptic+tagging:+mapping+corticocollicular+input-defined+neural+pathways+for+defense+behaviors.">AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV+serotype+1+transduction+efficiency+and+tropism+in+the+murine+brain.">Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain.</a> Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).</li><li>Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Stimulation+of+the+Basolateral+Amygdala+Increased+Theta-Modulated+Gamma+Oscillations+in+the+Hippocampus.">Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).</li><li>Buzsaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+probing+local+circuits:+high-density+silicon+probes+combined+with+optogenetics.">Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics.</a> Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).</li><li>Benardo, L. S., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+action+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Dopamine action on hippocampal pyramidal cells.</a> Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).</li><li>Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Upside+to+Reward+Sensitivity:+The+Hippocampus+Supports+Enhanced+Reinforcement+Learning+in+Adolescence.">An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence.</a> Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).</li><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward+and+Aversion.">Reward and Aversion.</a> Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).</li><li>Kahn, I., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+connectivity+between+the+hippocampus,+nucleus+accumbens,+and+ventral+tegmental+area+in+humans.">Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans.</a> Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).</li><li>Lisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+hippocampal+circuitry+to+function:+recall+of+memory+sequences+by+reciprocal+dentate-CA3+interactions.">Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions.</a> Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).</li><li>Lisman, J. E., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocampal-VTA+loop:+controlling+the+entry+of+information+into+long-term+memory.">The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory.</a> Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).</li><li>Broussard, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Regulates+Aversive+Contextual+Learning+and+Associated+In+Vivo+Synaptic+Plasticity+in+the+Hippocampus.">Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus.</a> Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).</li><li>Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1/D5+receptors+mediate+informational+saliency+that+promotes+persistent+hippocampal+long-term+plasticity.">Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity.</a> Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).</li><li>Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+rewarding+and+novel+events+in+facilitating+memory+persistence+in+a+separate+spatial+memory+task.">The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task.</a> Learning &amp; Memory. 21 (2), 61-72 (2014).</li><li>Ntamati, N. R., Luscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VTA+Projection+Neurons+Releasing+GABA+and+Glutamate+in+the+Dentate+Gyrus.">VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus.</a> eNeuro. 3 (4), (2016).</li><li>Yoo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+glutamate+neurons+co-release+GABA+and+promote+positive+reinforcement.">Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement.</a> Nature Communications. 7, 13697 (2016).</li><li>Funahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Memory+in+the+Prefrontal+Cortex.">Working Memory in the Prefrontal Cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+context+with+reward:+a+functional+circuit+from+hippocampal+CA3+to+ventral+tegmental+area.">Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area.</a> Science. 333 (6040), 353-357 (2011).</li><li>McNamara, C. G., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sources+of+dopamine+for+the+hippocampus.">Two sources of dopamine for the hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).</li><li>McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+promote+hippocampal+reactivation+and+spatial+memory+persistence.">Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence.</a> Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Anterograde+Transsynaptic+Tagging:+Mapping+Corticocollicular+Input-Defined+Neural+Pathways+for+Defense+Behaviors.">AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).</li><li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetics.">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi dieci anni, la progettazione dei costrutti AAV è progredita in modo significativo. Come tale, più promotori neuronali specifici sono stati incorporati in una serie di sierotipi AAV per una migliore specificità della trasfezione14. Combinando geni per proteine di fluorescenza, trasportatori, recettori e canali ionici, esistono ora librerie di AAV per l'imaging, la neuromodulazione e il rilevamento dell'attività sinaptica. Nei costrutti AAV disponibili in commercio, una combinazione...

Nell'ultimo decennio, è stata sviluppata una serie di strumenti genetici per aumentare la specificità della modulazione di tipo neuronale e la mappatura di reti neurali complesse1. In particolare, i virus neurotropici con una capacità intrinseca di infettare e replicarsi nelle cellule neuronali sono stati utilizzati per esprimere o ablare proteine specifiche in sottotipi di neuroni. Quando ospitano proteine di fluorescenza o indicatori di attività sinaptica geneticamente codificati, i vettori AAV trasfettate etichettano e delineano le reti neurali attraverso le regioni del cervello2,3. La scelta di un promotore nel costrutto AAV dirige l'espressione del vettore in tipi di neuroni con un certo livello di specificità (espressionepromotore-dipendente). Tuttavia, attraverso la ricombinazione Cre-lox, i costrutti AAV vengono distribuiti con maggiore specificità per l'etichettatura dei neuroni4,5,6,7. Da notare, le ossine microbiche fotoattivate e le proteine di fluorescenza confezionate in vettori AAV possono essere espresse in vari sottotipi di neuroni8e sono ideali per l'imaging, il tracciamento del circuito di tipo neuronale e la fotomodulazione9,10.
I costrutti AAV iniettati stereotassicamente in una regione del cervello (o nucleo) guidano l'espressione della proteina reporter nei terminali soma, dendrite e assoni. L'espressione neurale di AAV che ospita un gene reporter (eYFP) facilita l'etichettatura dei corpi cellulari neuronali e il tracciamento anatomico delle proiezioni da e verso altre regioni del cervello11,12,13,14. I costrutti AAV-eYFP che trasportano l'opsina controllata dalla luce (ad esempio, hChR2), possono essere utilizzati come strumento per l'imaging6,15 e il tracciamento fisiologico basato sulla stimolazione delle proiezioni neurali per indirizzare le aree cerebrali in vivo16. A seconda del sierotipo AAV, la direzione dell'etichettatura dei neuroni può essere anterograda o retrograda11,12. Studi precedenti hanno stabilito che AAV5 viaggia anterogradamente nei neuroni12. Pertanto, la fotostimolazione dei corpi cellulari che esprimono hChR2 produce effetti presinaptici altrove nel cervello (target)17.
Qui, AAV (sierotipo 5) con un promotore CaMKIIα è stato utilizzato per esprimere eYFP (reporter) e hChR2 (opsina) nei neuroni del glutammato VTA e nelle proiezioni assonali. I risultati di questo studio dimostrano la distribuzione dipendente dallo strato dei terminali presinaptici VTA-glutammato nelle regioni ippocampali CA1, CA3 e DG. Inoltre, la fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA ha aumentato i tassi di attivazione di CA1 multi-unità e singola unità in vivo rispetto ai valori basali. Questo protocollo utilizza strumenti a prezzi accessibili e software disponibili in commercio che possono aumentare la qualità dei dati ottenuti da esperimenti di tracciamento dei circuiti neurali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>H312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV-CaMKII&#945;-ChR2-eGYP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #26969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cable</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC Splitter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Split Mating Sleeve for &#216;1.25mm Ferrules.</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ADAL1-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>LR 39098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin coated slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>OBSLD01CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton&#39;s syringe (Neuros)</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>06H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage adapter</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Adpt-Q4-OM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High impedance silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INTAN 512ch Recording Controller</td>
			<td>INTAN</td>
			<td>RHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>K1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Driver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source (470 nm)-blue light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M470F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M0-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFMLC14L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan head philips screw (M0.6 X 2mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>M0.6 X 2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-amplifier headstage (32 Channel)</td>
			<td>INTAN</td>
			<td>C3314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTL pulser</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intan Recording Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuroexplorer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexon Offline Spike Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF Composition:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined in vivo anatomical and functional tracing of ventral tegmental area glutamate terminals in the hippocampus

La modulazione optogenetica delle sotto-popolazioni neuronali nel cervello ha permesso ai ricercatori di sezionare circuiti neurali in vivo ed ex vivo. Ciò fornisce una premessa per determinare il ruolo dei tipi di neuroni all'interno di un circuito neurale e il loro significato nella codifica delle informazioni relative all'apprendimento. Allo stesso modo, il metodo può essere utilizzato per testare il significato fisiologico di due o più regioni cerebrali collegate in animali svegli e anestetizzati. Il presente studio dimostra come i neuroni del glutammato VTA modulano il tasso di attivazione dei neuroni piramidali putativi nel CA1 (ippocampo) dei topi anestetizzati. Questo protocollo utilizza l'etichettatura dipendente dal virus adeno-associato (AAV) dei neuroni del glutammato VTA per il tracciamento dei terminali presinaptici del glutammato VTA negli strati dell'ippocampo. L'espressione di opsina controllata dalla luce (channelrhodopsin; hChR2) e proteina di fluorescenza (eYFP) ospitata dal vettore AAV ha permesso il tracciamento anterogrado dei terminali del glutammato VTA e la fotostimolazione dei corpi delle cellule neuronali del glutammato VTA (nel VTA). Elettrodi di silicio acuto ad alta impedenza sono stati posizionati nel CA1 per rilevare risposte multi-unità e singola unità alla fotostimolazione VTA in vivo. I risultati di questo studio dimostrano la distribuzione dipendente dallo strato dei terminali presinaptici del glutammato VTA nell'ippocampo (CA1, CA3 e DG). Inoltre, la fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA ha aumentato il tasso di attivazione e scoppio delle presunte unità piramidali CA1 in vivo.

Tracciatura anterograda
L'espressione di AAV è stata verificata mediante imaging a immunofluorescenza della proteina reporter (eYFP) nel VTA di topi C57BL/6 21 giorni dopo l'iniezione (Figura 2). Il successo dell'etichettatura anterograda delle proiezioni di glutammato VTA presinaptico nell'ippocampo è stato verificato anche dal rilevamento eYFP negli strati di DG, CA3 e CA1(Figura 6a-d; Film 2 e 3)...

Watch this Scientific Journal Video about Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus at JoVE.com

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Views.  Louisiana State University School of Veterinary Medicine. L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

Video: Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...