Tracciamento del lignaggio e analisi clonale nello sviluppo della Corteccia cerebrale utilizzando l'analisi mosaica con doppi marcatori (MADM)

L'analisi del mosaico con tecnologia Double Markers è un metodo potente in grado di fornire informazioni altamente quantitative sul comportamento di proliferazione e sui risultati delle cantine delle cellule staminali degli individui. Una caratteristica unica di questa tecnica, è che consente il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di cellula singola.demontrating alla procedura sarà, Carmen Streicher, la tua tecnica, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc e Andy Hansen, una dottoranda del mio laboratorio. Per indurre eventi di ricombinazione MADM in topi sperimentali, utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 25 per fornire una singola iniezione di Tamoxifen Intraperitoneal in una diga a tempo in gravidanza. Dall'analisi clonale MADM ai punti di tempo postnatali. Nei giorni embrionali da 18 a 19, mettere un topo incinta in posizione supina e disinfettare la pelliccia con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione nella pelle nell'addome inferiore sopra l'utero e fai una seconda incisione attraverso i muscoli e la parete muscolare addominale per rivelare il peritoneo. Utilizzare le forbici per separare l'utero dai tessuti circostanti e posizionare l'utero intatto in un guanto con acqua tiepida. Quindi utilizzare forbici e dita a punta fine per aprire attentamente le pareti uterine per rilasciare gli embrioni. Pulire i cuccioli premendo delicatamente i forzieri di tanto in tanto per iniziare a respirare prima di trasferire gli animali prenatali a una madre adottiva. Per raccogliere il tessuto clone MADM neurale posizionare un animale anestetizzato in posizione supina su un vassoio di chirurgia perfusione e disinfettare la pelliccia con il 70% di etanolo. Usa forbici e forcep per fare un'incisione attraverso la pelle e un'incisione attraverso lo strato muscolare. Quando la cavità toracica è visibile, annusare e sollevare il diaframma per rivelare il cuore e tagliare e fissare con cura la gabbia toracica al vassoio chirurgico.inserire un ago collegato a un tubo di pompazione peristaltico riempito con PBS nel ventricolo in basso a sinistra del cuore e utilizzare piccole forbici Iris per fare un'incisione nell'estremità posteriore dell'atrio destro. Perfondere il sistema cardiovascolare con il PBS seguito immediatamente da perfusione con ghiaccio freddo appena preparato 4% paraformaldeide in PBS. Quando la perfusione è completa, rimuovere il cervello attraverso un'attenta dissezione e posizionare l'organo raccolto in almeno cinque volte il volume cerebrale di paraformaldeide fresca al 4% durante la notte alle 4