Questo protocollo è facile da eseguire. La fase di clonazione consente di ottenere un numero maggiore di cloni T da campioni freschi. Inoltre, il fenotipo e la funzione delle cellule T possono essere facilmente analizzati.
A dimostrare la procedura sarà Mary Christopher, una dottoranda del mio laboratorio. Per indurre la clonazione delle cellule T, utilizzare la punta del sacchetto con la valvola priva di ago per aprire una sacca di buffy coat irradiata in una cappa a flusso laminare. Trasferire fino a 50 millilitri di sangue dalla sacca in un pallone T-150 e aggiungere 70 millilitri di PBS al pallone.
Stratificare con cura 30 millilitri di sangue diluito su 20 millilitri di gradiente di densità in ciascuno dei quattro tubi conici da 50 millilitri e separare le cellule mediante centrifugazione a gradiente di densità. Aspirare accuratamente il surnatante e trasferire il PBMC da ciascun tubo in un unico nuovo tubo da 50 millilitri. Utilizzare PBS per portare il volume finale a 50 millilitri e raccogliere il PBMC mediante centrifugazione.
Dopo un secondo lavaggio nelle stesse condizioni, sospendere le celle di alimentazione isolate in 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per il conteggio e aggiungere 25 millilitri di un terreno di coltura cellulare da 70 millilitri integrato con 50 unità di soluzione di IL-2 in ciascuno dei due tubi da 50 millilitri. Quindi aggiungere le cellule di alimentazione a un tubo a 2 per 10 alla 6a cella per millilitro di terreno di coltura cellulare integrato con concentrazione di IL-2. Per impostare una coltura di linfociti T, raggruppare il clone di cellule T contenente supernatanti dal pallone campione della valvola stenotica in un singolo tubo da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.
Lavare il pellet tre volte in 50 millilitri di PBS per lavaggio, prima di risospendere le celle in 1 millilitro di terreno di coltura cellulare per il conteggio. Diluire le cellule a una concentrazione di 1 per 10 a 3 cellule per millilitro e aggiungere 500 microlitri di cellule al tubo del terreno di coltura cellulare integrato con IL-2 senza cellule di alimentazione. Aggiungere la sospensione della cella di alimentazione a una capsula di Petri di plastica da 100 per 15 millilitri e aggiungere 100 microlitri di celle di alimentazione a ciascun pozzetto del numero appropriato di piastre a 96 pozzetti con fondo a U per l'esperimento.
Quindi aggiungere le cellule T a una capsula di Petri e aggiungere 100 microlitri di cellule T a ciascuna cellula di alimentazione integrata bene per un'incubazione di una settimana nell'incubatore di colture cellulari. L'isolamento PBMC è vitale per ottenere cellule di alimentazione e consentire il rilevamento e la caratterizzazione di leucociti infiltrati in campioni di valvola aortica. Dopo due settimane di incubazione, è possibile ottenere una popolazione di cellule T clone.
Qui, viene mostrato lo schema di gating per l'analisi delle sottopopolazioni di cellule T in pazienti con malattia della valvola aortica calcifica. Come osservato in questo paziente, c'erano più cellule CD4 + T rispetto alle cellule CD8 + T. L'analisi citometrica a flusso di cellule T non clonate conferma che gli stessi marcatori di cellule T sono presenti sia in campioni di valvole native che di cloni.
Presi insieme, questi dati indicano che le cellule T sono presenti nelle valvole aortiche calcificate con leucociti CD45 +, suggerendo che la malattia della valvola aortica calcifica è legata all'attivazione del sistema immunitario e all'attività infiammatoria. Questo metodo è molto versatile. Può essere applicato a diversi protocolli per i quali il ricercatore deve essere in grado di isolare le cellule da un tessuto, per la caratterizzazione funzionale.
Tieni presente che è importante lavorare in condizioni sterili per evitare la contaminazione e osservare criticamente le cellule al microscopio.
