Questo protocollo può essere implementato nella maggior parte dei laboratori di biologia dello sviluppo dell'esofago, consentendo ai ricercatori che non hanno accesso ai microscopi a super risoluzione di produrre immagini a super risoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di aggirare il limite di diffrazione della microscopia confocale convenzionale senza richiedere un microscopio a super risoluzione espandendo il campione stesso. Questo protocollo sarà utile per coloro che studiano come la localizzazione delle proteine influenzi la morfologia o la funzione cellulare negli embrioni intatti, in particolare quando tali proteine sono organizzate in strutture o reti subcellulari complesse.
Il problema più comune che le persone incontrano è la perdita di embrioni durante il protocollo. Si consiglia di applicare più mani di Poli-L-Lisina per far aderire saldamente gli embrioni. Dopo gli embrioni, prendi una base di plastica di sei centimetri riempita per metà con agar al 3%.
Incidete un rettangolo di cinque centimetri per tre nell'agar con una lama di rasoio o un bisturi. Rimuovere la lastra di agar utilizzando una piccola spatola da laboratorio. Quindi capovolgere la base della piastra di Petri, posizionarla sul banco e posizionare la lastra di agar sopra la piastra capovolta.
Rimuovere il coperchio dalla piastra di Petri e assicurarsi che sia asciutto. Usando i guanti, attacca un pezzo di nastro biadesivo all'interno del coperchio. Estrarre le fiale contenenti gli embrioni rivestiti e fissati dall'agitatore e posizionarle verticalmente sul banco di lavoro.
Lasciare che le fasi organiche e acquose si separino. Gli embrioni correttamente fissati dovrebbero rimanere alla loro interfaccia. Rimuovere completamente la fase acquosa inferiore utilizzando una pipetta Pasteur e una pipetta P200.
Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro dotata di un bulbo in lattice per trasferire gli embrioni fissati su una lastra di agar in più piccoli lotti in modo che non aderiscano all'interno della pipetta. Una volta che gli embrioni sono sulla lastra di agar, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere l'eptano rimanente vicino agli embrioni. A questo punto, far cadere il coperchio del nastro biadesivo sulla lastra di agar da un'altezza di due centimetri per far aderire gli embrioni al nastro.
Rimuovere delicatamente il coperchio dalla lastra di agar, posizionarla capovolta sul banco e aggiungere PBS Tween a sufficienza per coprire gli embrioni nel coperchio. Per raccogliere gli embrioni desiderati, utilizzare uno stereomicroscopio da dissezione a 100x con illuminazione indiretta. Bucherellare la membrana vitellina vicino all'estremità anteriore o posteriore dell'embrione con un ago di vetro sottile per sgonfiarla e rilasciare la pressione.
Utilizzare una pinza fine o una sonda metallica per spingere delicatamente l'embrione attraverso il foro con la membrana vitellina ancora aderente al nastro biadesivo. Lasciare gli embrioni indesiderati sul nastro. Utilizzare periodicamente una pipetta di vetro Pasteur per raccogliere eventuali embrioni devitellinizzati galleggianti e spostarli in una provetta microfuge da 1,5 millilitri.
Preparare la soluzione PDMS in un tubo conico da 50 millilitri e creare un tubo bilanciato aggiungendo una quantità appropriata di acqua a un secondo tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare la soluzione PDMS a 500G per tre minuti a 15 gradi Celsius. Quindi versarlo in una capsula di Petri da 10 centimetri a una profondità di un millimetro.
Lasciare solidificare la soluzione PDMS durante la notte a 55 gradi Celsius. Una volta che la lastra PDMS è solidificata, incidere aree quadrate leggermente più piccole di un vetrino coprioggetto di 22 x 22 millimetri utilizzando un bisturi. All'interno di ogni quadrato, incidete e rimuovete un quadrato largo otto millimetri.
trasferire bene ogni PDMS quadrato su un vetrino coprioggetto di 22 x 22 millimetri e farlo aderire saldamente. Per far aderire gli embrioni ai vetrini copricopertini, applicare una quantità sufficiente allo 0,1% di poli-L-lisina per coprire la superficie del vetrino coprioggetto all'interno di ciascun pozzetto e metterli ad asciugare in un'incubatrice a 55 gradi Celsius. Sciacquare brevemente gli embrioni e il PBS per rimuovere il detersivo Tween.
Quindi trasferire più di 10 embrioni in ogni pozzetto rivestito di poli-L-lisina. Lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo dei pozzetti. Rimuovere il liquido in eccesso dagli embrioni aderenti utilizzando una pipetta Pasteur e procedere immediatamente alla fase successiva.
Mentre gli embrioni si trovano nella soluzione di monomero, preparare una soluzione di gelificazione per coprire i pozzetti PDMS. Diluire l'ossidante catalitico appena estratto dalla polvere. Combinare 3.920 microlitri di soluzione monomerica con 60 microlitri di TEMED al 10% e 20 microlitri di TEMPO all'1%.
Dividere la soluzione di gelificazione in aliquote da 125 microlitri in più provette PCR. Rimuovere la soluzione di monomero dai pozzetti PDMS utilizzando un vuoto o una pipetta, facendo attenzione a non distruggere gli embrioni. Aggiungere cinque microlitri di APS a una delle provette PCR contenenti la soluzione di gelificazione per avviare la polimerizzazione.
Distribuire rapidamente la soluzione di gelificazione polimerizzante tra i tre pozzetti. Ripetere l'operazione fino a coprire tutti i pozzetti e gli embrioni. Lasciare gelificare i campioni per 1,5-2,5 ore a 37 gradi Celsius.
Gli idrogel più densi impiegheranno più tempo per completare la polimerizzazione e solidificare. Agitare spesso gli idrogel per monitorare la polimerizzazione. Una volta solidificati, gli idrogel non si muovono.
Dopo la gelificazione, staccare i pozzetti PDMS dal vetrino coprioggetto senza disturbare gli idrogel. Trasferire gli idrogel singolarmente nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Gli idrogel possono espandersi leggermente durante la digestione.
Coprire completamente i gel con il tampone digestivo. 30 millilitri di tampone digestivo sono sufficienti per coprirli in una piastra a sei pozzetti e incubarli per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo la digestione, spostare gli idrogel in una capsula di Petri di sei centimetri e riempirla con acqua deionizzata per espandersi.
A questo punto gli idrogel possono staccarsi dai vetrini di copertura ed espandersi di quattro volte in dimensione lineare. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere quanta più acqua in eccesso possibile dalla capsula di Petri per ridurre al minimo il movimento dei gel durante la manipolazione. Manovrare i gel espansi con gli embrioni sulla superficie inferiore su un ampio vetrino coprioggetto per l'imaging.
Montare ogni vetrino coprioggetto con gel sull'obiettivo di un microscopio confocale a scansione laser invertita. Dopo aver individuato i campioni correttamente posizionati e orientati, sono passati a un obiettivo ad immersione in olio o acqua ad alto ingrandimento per ottenere l'immagine ad alta risoluzione. La misurazione della lunghezza dell'embrione lungo l'asse testa-coda con un obiettivo 10x ha mostrato che gli embrioni non espansi coprivano circa la metà di un campo visivo, mentre gli embrioni espansi coprivano circa due campi visivi completi.
La lunghezza media della testa alla coda degli embrioni di controllo non espansi era di 398,8 micrometri. Per gli esperimenti uno, due e tre, la lunghezza media degli embrioni era costituita da fattori di espansione rispettivamente di 4,0 volte, 4,7 volte e 4,9 volte. Nel campione di controllo, le cellule del segmento mascellare avevano una larghezza media di 4,76 micrometri.
Nei campioni espansi, le cellule nel segmento mascellare avevano una larghezza media di 19,10 micrometri, che rappresenta un'espansione di 4,0 volte. Il citoscheletro dell'actomiosina è stato visualizzato in controllo non espanso rispetto agli embrioni espansi, sottoposti a estensione convergente. Apparivano come un'unica linea in cui si incontravano le cellule vicine.
Al contrario, negli embrioni in stadio sette espanso, è stato possibile osservare linee parallele di miosina due alle giunzioni cellulari, che rappresentano pool proteici corticali nelle cellule adiacenti. Negli embrioni non espansi allo stadio sei, i mitocondri marcati con streptavidina apparivano come una foschia citoplasmatica eterogenea senza chiari dettagli subcellulari. Tuttavia, negli embrioni espansi, numerosi punti erano risolvibili all'interno del citoplasma, probabilmente rappresentando mitocondri frammentati o porzioni della rete mitocondriale.
Una cosa importante da ricordare quando si tenta questa procedura è proteggere gli embrioni dall'eccessiva esposizione alla luce dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi.
