Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo della microscopia ad espansione ultrastrutturale in tre fasi del ciclo di vita in vitro di Trypanosoma cruzi, il patogeno responsabile della malattia di Chagas. Questo protocollo offre un'alternativa alle attuali tecniche di imaging a super risoluzione e microscopia elettronica, con il vantaggio di essere compatibile con i microscopi convenzionali presenti nella maggior parte dei laboratori di biologia e nelle strutture di base delle macchine. Utilizza tecniche comuni per la maggior parte dei laboratori di ricerca per ottenere immagini che consentono la ricostruzione tridimensionale.
Il protocollo facilita lo studio di strutture su scala nanometrica nei tripanosomatidi, consentendo l'ispezione di una popolazione di cellule e l'imaging dell'intero volume di una cellula di interesse ad alta risoluzione. È particolarmente utile per i tipi di cellule specifici della scienza nelle fasi transitorie del ciclo cellulare e della differenziazione. Per ottenere una risoluzione ancora maggiore, utilizzeremo la combinazione di ExM con tecniche microscopiche a super risoluzione per raggiungere risoluzioni inferiori a 20 nanometri.
Iniziare preparando la sospensione di Trypanosoma cruzi epimastigote da una coltura in fase logaritmica in terreno LIT integrato con il 10% di FCS. Centrifugare la sospensione a 5.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare il pellet due volte con PBS, quindi risospendere in 200 microlitri di PBS.
Far aderire la sospensione a un vetrino coprioggetti rotondo da 12 millimetri rivestito con poli-D-lisina e incubarlo a temperatura ambiente per 15-20 minuti prima della prevenzione della reticolazione. Raccogliere il surnatante di un monostrato di cellule Vero infettato con i tripomastigoti quattro giorni dopo l'infezione. Utilizzando una camera di conteggio delle cellule Neubauer, determinare la concentrazione dei tripomastigoti.
Centrifugare la sospensione cellulare a 7.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato e risospeso le cellule in PBS, trasferire la sospensione cellulare in un vetrino coprioggetti rivestito di lisina e incubare il vetrino coprioggetti a temperatura ambiente per 10-15 minuti prima della prevenzione della reticolazione. Per ottenere amastigoti dalle cellule Vero infette, stendere un vetrino coprioggetti rotondo sterile da 12 millimetri sul fondo di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.
Successivamente, preparare una sospensione di cellule Vero in DMEM integrata con il 2% di FCS e seminare 500 microlitri di sospensione in ciascun pozzetto. Incubare la piastra durante la notte per garantire l'adesione delle cellule. Quindi, lavare le cellule due volte con 500 microlitri di PBS sterile.
Aggiungere T. cruzi trypomastigotes nelle celle e incubare come precedentemente per sei ore. Inizia aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di prevenzione della reticolazione a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Quindi, immergere i vetrini coprioggetti rivestiti di poli-D-lisina da 12 millimetri con parassiti aderenti.
Dopo aver riempito i pozzetti vuoti con acqua per ridurre l'evaporazione, sigillare la piastra con una pellicola sigillante e incubare. Per gelificare i campioni, assemblare prima una camera umida in una capsula di Petri posizionando una pellicola sigillante sopra la carta velina. Quindi, bagnare la carta velina con acqua e incubare a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti per raffreddarla.
Stendere la camera fredda e umida sul ghiaccio. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur da tre millilitri, aspirare la soluzione di prevenzione della reticolazione dai pozzetti della piastra a 24 pozzetti. Ora, usa una pinzetta per rimuovere i vetrini coprioggetti e posizionali sulla carta velina con i parassiti rivolti verso l'alto.
Prendi 90 microlitri di soluzione monomerica in un tubo e aggiungi cinque microlitri ciascuno di TEMED e APS scongelati. Agitare il composto per due o tre secondi. Pipettare 35 microlitri di questa miscela sulla pellicola sigillante per ogni vetrino coprioggetti e utilizzare immediatamente una pinzetta per posizionare i vetrini coprioggetti sulla goccia con i parassiti rivolti verso il basso.
Incubare la camera umida sul ghiaccio per cinque minuti, quindi a 37 gradi Celsius per un'ora. Iniziare pipettando due millilitri di soluzione di denaturazione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Trasferire i vetrini gelificati contenenti parassiti Trypanosoma cruzi nella soluzione di denaturazione e incubare agitando delicatamente.
Per favorire il distacco del gel. Utilizzando una spatola metallica, trasferire con cura il gel in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di soluzione di denaturazione. Incubare la provetta con un tappo di sicurezza su un blocco riscaldante.
Utilizzare una pipetta P1000 per aspirare la soluzione di denaturazione dalle provette della microcentrifuga. Con una spatola metallica, trasferire il gel in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di acqua ultrapura e lasciarlo agire per 30 minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta da tre millilitri, sostituire l'acqua ultrapura nel piatto, lasciando il gel immerso per una notte a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, misurare il diametro del gel con un calibro per calcolare l'espansione. I campioni erano visibili come un gel planare e traslucido che si espandeva da 4 a 4,5 volte in acqua. Inizia l'etichettatura fluorescente lavando i cerchi di gel espanso contenenti i parassiti con PBS.
Usa una lama di rasoio per tagliare i cerchi al centro in quadrati di 10 per 10 millimetri. Ora, trasferire ogni quadrato in una piastra a 12 pozzetti e incubarlo in 500 microlitri di anticorpo primario diluito in PBS al 2% e BSA, con agitazione. Successivamente, incubare i quadrati di gel in una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di PBS con polisorbato 20 allo 0,1% per 10 minuti, agitando.
Dopo aver trasferito il gel in una piastra a 12 pozzetti, aggiungere 500 microlitri di anticorpo secondario in PBS con DAPI e 10 microgrammi per millilitro di estere NHS coniugato al fluoroforo desiderato. Incubare il gel per 2,5 ore a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione. Dopo aver lavato tre volte il gel in polisorbato PBS 20 come in precedenza, trasferire il gel in una capsula di Petri con acqua ultrapura e incubare per 30 minuti.
Posizionare un quadrato di 10 x 10 millimetri del pezzo di gel espanso su un piatto inferiore di 35 millimetri. Controllare l'orientamento dei parassiti con un ingrandimento di 10 o 20X. Visualizzare i campioni in un microscopio confocale con un obiettivo a immersione in olio 63X, con apertura numerica di 1,4.
Acquisisci gli Z-stack, la larghezza di ciascun passo Z e il tempo di esposizione per pixel determinato empiricamente, quindi acquisisci l'intensità del segnale e l'ottimizzazione dei tempi di acquisizione utilizzando lo zoom di scansione per un ingrandimento efficace, se lo desideri. Aprite lo Z-stack utilizzando il software di elaborazione delle immagini e raggruppate le immagini impilate utilizzando l'opzione di progetto Z di gruppo per ciascun canale. Quindi, selezionare la proiezione dell'intensità massima.
Unisci le immagini utilizzando lo strumento Unisci canali. Seleziona il colore di ciascun canale e aggiungi la barra di scala utilizzando lo strumento Barra di scala nel software di elaborazione. L'espansione primaria ha fornito una risoluzione effettiva di 70 nanometri, mentre l'espansione secondaria ha mostrato fattori di espansione di circa 4,5.
La colorazione di tutte e tre le fasi del ciclo di vita in vitro di T.cruzi con marcatori citoscheletrici ha mostrato la localizzazione della proteina del corsetto microtubulare e dell'assonema flagellare. La condensazione della cromatina era chiaramente distinta quando colorata con DAPI. L'immunolocalizzazione dei marcatori dell'alfa tubulina sovrapposti alla marcatura del proteoma pan negli epimastigoti ha mostrato che il corpo basale colorato con anti-alfa-tubulina e FITC si era diviso.
L'etichettatura del proteoma Pan ha aiutato a identificare diverse strutture di parassiti in tutte le fasi del ciclo di vita.
