Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH 5R01NS051305-14 e 5R01NS076980-08 a PJS.

1. Preparazione sperimentale
<ol><li>Raccogli le mosche mentre si chiude in fiale, separando le mosche maschili e femminili. NOTA: gli esperimenti sul sonno sono comunemente condotti con mosche femmine. È importante raccogliere femmine vergini. Le femmine accoppiate deporteranno uova che si schiudono in larve complicando l'analisi dei dati.</li>
	<li>Mosche domestiche di un solo sesso in gruppi di <20. NOTA: l'alloggiamento vola in un ambiente socialmente arricchito (gruppi di >50) modula il sonno6,13 misurazioni potenzialmente confondenti del sonno di rimbalzo. Inoltre, a seguito dell'arricchimento sociale, il sonno diminuirà in pochi giorni6. Pertanto, il sonno basale non è stabile complicando l'analisi del sonno di rimbalzo. Mantenere le mosche in gruppi di <20 evita questo potenziale confusione.</li>
	<li>Tenere le mosche in fiale per 3-5 giorni in un ambiente controllato dalla luce e dall'umidità. NOTA: L'età e la maturità delle mosche influenzano fortemente il sonno. Il sonno è alto nelle mosche di un giorno e si stabilizza entro 3-5 giorni di età4. Le mosche sono in genere mantenute su una luce di 12 ore: 12 ore di buio al 50% di umidità.</li>
</ol>2. Preparazione dei tubi per la registrazione del sonno
NOTA: il sonno viene monitorato utilizzando monitor di attività locomotoria. Un monitor può contenere 32 mosche alloggiate singolarmente in tubi di diametro 5 mm. Tipicamente, i genotipi vengono analizzati in gruppi di 16 o 32 mosche.
<ol><li>Preparare un numero appropriato di tubi con cibo volante a un'estremità. NOTA: La dieta e il metabolismo sono noti per influenzare il sonno33,34, quindi è particolarmente importante posizionare le mosche sullo stesso cibo su cui sono state allevate.</li>
	<li>Sigillare l'estremità dei tubi con cera. NOTA: la privazione del sonno e il rimbalzo sono un esperimento di cinque giorni e il cibo può asciugarsi se non adeguatamente sigillato. In tubi adeguatamente sigillati, il cibo può essere mantenuto per 10 giorni o più. Pertanto, è fondamentale assicurarsi che le estremità dei tubi siano ben sigillate. Tuttavia, le mosche possono anche rimanere attaccate al cibo umido. Pertanto, aiuta a realizzare tubi 1-2 giorni prima dell'inizio dell'esperimento.</li>
	<li>Posizionare individualmente la scia, comportandosi mosche in tubi di vetro lunghi 65 mm per la registrazione del sonno utilizzando un aspiratore e collegare l'estremità dei tubi con un tappo di schiuma. NOTA: le mosche non vengono mai riconseposte all'anestesia co2 quando inseriscono le mosche in tubi per la registrazione del sonno. L'aspiratore è costituito da tubi di gomma con un'estremità ricoperta di garza e inserita in una punta della pipetta da 1 mL.</li>
</ol>3. Registrazione del sonno
<ol><li>Carica le mosche in tubi nei monitor di attività per monitorare il sonno. NOTA: le rocce SNAP monitorano avanti e indietro da -60° a +60° ogni ~10 s. I monitor sono tenuti a -60 ° per ~ 5.9s ; ci vogliono ~ 2,9 s perché il vassoio che tiene i monitor passi da -60 ° a +60 ° e ~ 1 s per tornare indietro da +60 ° a -60 °. La lunghezza del ciclo può essere modificata secondo necessità regolando la tensione fornita al motore.<ol>
<li>Fare attenzione a garantire che i tubi siano posizionati nei monitor di attività con l'orientamento corretto. Nell'orientamento corretto, l'estremità del tubo con il cibo è nella parte superiore dello SNAP per garantire che le mosche non vengano spinte nel cibo. Inoltre, la fine con il cibo è sul lato del monitor con il jack di registrazione del sonno. Ciò consente ai monitor di attività di essere orientati correttamente nello SNAP per un'efficiente privazione del sonno e contemporaneamente monitorare l'attività.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare i monitor di attività nella camera di registrazione per monitorare il sonno.</li>
	<li>Monitorare il sonno per almeno due giorni interi per stimare il sonno basale. NOTA: il giorno in cui le mosche vengono caricate nei monitor di attività è in genere escluso come giorno di adattamento per consentire alle mosche di adattarsi ad essere alloggiate in tubi. Il sonno di base viene registrato per almeno due giorni interi (48 ore) a partire dalla mattina successiva al giorno in cui vengono caricate le mosche.</li>
	<li>Salva il conteggio dell'attività locomotoria delle mosche nei contenitori di 1 minuto dal momento delle luci di un determinato giorno alle luci del giorno precedente utilizzando il software di registrazione delle attività (ad esempio, dalle 8:00 alle 8:00).</li>
	<li>Stimare il sonno dai dati dell'attività locomotoria con macro personalizzate utilizzando 5 minuti di inattività come soglia per un attacco di sonno35. NOTA: un certo numero di metriche del sonno vengono calcolate dai conteggi dell'attività locomotoria. Questi includono il sonno in min / h oltre 24 ore, il tempo di sonno totale in 24 ore, la durata media e massima del sonno diurno e notturno36.</li>
</ol>4. Privazione del sonno e recupero
<ol><li>Poiché le mosche possono essere private del sonno per periodi di tempo variabili (ad esempio, 12 h, 24 h e 36 h) e il sonno di recupero può anche essere valutato a vari intervalli (ad esempio, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h), determinare la durata del recupero per necessità sperimentale. Il recupero del sonno può essere visualizzato utilizzando un grafico di guadagno / perdita di sonno o esaminando la percentuale di sonno recuperato in un intervallo predeterminato (ad esempio, 6 ore).</li>
	<li>Se il sonno è stabile nei due giorni di base, il terzo giorno, inserire i monitor di attività nello SNAP per la privazione del sonno durante la notte. NOTA: le mosche mostreranno un robusto rimbalzo del sonno su un intervallo di tempi di sonno8,32,37,38,ma il sonno deve essere stabile per valutare in modo affidabile il sonno di rimbalzo. Il sonno è stabile quando la differenza di sonno tra i giorni di base è di ± 100 minuti.</li>
	<li>Assicurarsi che i monitor di attività siano fissati in posizione con i pin del supporto del monitor, i cavi del monitor collegati e i monitor orientati correttamente con l'estremità con il cibo sul retro e le barriere di plastica davanti (Figura 1). NOTA: SNAP è progettato in modo che la camma ruoti una volta ogni 10 s (Figura 1). L'inserto in plastica ripristina i tubi spingendo i tubi indietro quando l'apparecchio è in posizione "up". Il ripristino dei tubi è importante per garantire che tutti i tubi abbiano l'intera gamma di movimento all'inizio di ogni ciclo.</li>
	<li>Scollegare i monitor di attività e togliere i monitor dallo SNAP immediatamente dopo l'accendersi dopo la privazione del sonno durante la notte. NOTA: è fondamentale che la privazione del sonno sia terminata e che le mosche siano poste in recupero immediatamente dopo le luci accese dopo 12 ore di privazione del sonno durante la notte. Anche un ritardo di 20-30 minuti nel mettere le mosche in recupero può interferire con l'estensione del sonno di rimbalzo.</li>
	<li>Posiziona le mosche in una camera di registrazione dove saranno indisturbate per due giorni (48 ore) per monitorare il sonno di recupero. NOTA: Se la camera di registrazione viene utilizzata per altri esperimenti, è necessario prestare particolare attenzione per evitare di stimolare il recupero delle mosche.</li>
	<li>Calcola la quantità di sonno perso. Per ogni singola mosca, calcolare la differenza oraria tra il sonno ottenuto durante la privazione del sonno e l'ora corrispondente durante il basale; sommare le differenze orarie per calcolare il sonno totale perso.</li>
	<li>Calcola la quantità di sonno recuperato. Per ogni singola mosca, calcolare la differenza oraria tra il sonno ottenuto durante il recupero e l'ora corrispondente durante il basale; sommare le differenze orarie per calcolare il sonno totale guadagnato. NOTA: Se una mosca è effettivamente privata del sonno è empirico. Pertanto, lo sperimentatore dovrebbe esaminare la percentuale di sonno perso. Se la mosca non ha perso una quantità sufficiente di sonno può essere esclusa dall'analisi. Anche se questo potrebbe essere richiesto per altri approcci di privazione del sonno, è raramente se mai richiesto per lo SNAP. Più comunemente, il sonno potrebbe non essere stabile in una determinata mosca prima dell'inizio della privazione del sonno. Se il sonno non è stabile, l'omeostasi non può essere calcolata. Accettiamo una differenza massima di ± 100 minuti di sonno calcolata prima dell'inizio della privazione del sonno come candidati per l'inclusione. A volte, il sonno di una singola mosca è distribuito in modo non uniforme durante il giorno di 24 ore (ad esempio, alcuni individui possono ottenere il 60-70% della loro quota di sonno durante il giorno e quindi perdere solo una piccola parte della loro quota di sonno di 24 ore quando privati per 12 ore di notte). Queste mosche possono essere valutate separatamente.</li>
	<li>Calcola la percentuale media di sonno recuperato (rispetto al basale) su 12 ore, 24 ore e 48 ore del periodo di recupero per ciascun genotipo.</li>
	<li>Dai dati del sonno, calcola la durata media e massima del sonno diurno sul basale e i giorni di recupero per ciascun genotipo. NOTA: il sonno di rimbalzo nelle mosche è caratterizzato da una maggiore quantità di sonno e da una maggiore profondità del sonno nei giorni di recupero. Il consolidamento del sonno viene utilizzato come misura della profondità del sonno. Le soglie di eccitazione potrebbero anche essere utilizzate come misura della profondità del sonno.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nath, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Jellyfish+Cassiopea+Exhibits+a+Sleep-like+State.">The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State.</a> Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).</li><li>Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sleep+in+Aplysia+californica.">Characterization of sleep in Aplysia californica.</a> Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+sleep+recordings+in+Drosophila:+moving+beyond+sleep+time.">Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time.</a> Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+sleep+regulatory+genes+using+a+Drosophila+model+of+insomnia.">Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia.</a> Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).</li><li>Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Hyperkinetic+mutants+have+reduced+sleep+and+impaired+memory.">Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory.</a> Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).</li><li>Geissmann, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethoscopes:+An+open+platform+for+high-throughput+ethomics.">Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics.</a> PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 8454 (2015).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).</li><li>Klose, M., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep-drive+reprograms+clock+neuronal+identity+through+CREB-binding+protein+induced+PDFR+expression.">Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Dissel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+restores+behavioral+plasticity+to+Drosophila+mutants.">Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants.</a> Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).</li><li>Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acid+binding+proteins+modulate+sleep+and+enhance+long-term+memory+consolidation+in+Drosophila.">Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sonno in Drosophila è stato caratterizzato in modo indipendente nel 2000, da due gruppi4,5. In questi studi pionieristici, le mosche sono state private del sonno da una manipolazione delicata (cioè la privazione della mano) e hanno dimostrato di mostrare una robusta risposta omeostatica alla privazione del sonno notturno. È importante sottolineare che con qualsiasi esperimento di privazione del sonno è fondamentale controllare i potenziali effetti...

Il sonno è quasi universale negli animali, ma la sua funzione rimane poco chiara. L'omeostasi del sonno, l'aumento compensatorio del sonno dopo la privazione del sonno, è una proprietà determinante del sonno, che è stata utilizzata per caratterizzare gli stati del sonno in un certo numerodi animali1,2,3,4,5.
Il sonno nella mosca ha molte somiglianze con il sonno umano, tra cui una robusta risposta omeostatica alla perdita di sonno4,5. Numerosi studi sul sonno nella mosca hanno utilizzato la privazione del sonno sia per dedurre la funzione del sonno esaminando le conseguenze negative che derivano dalla veglia prolungata, sia per comprendere la regolazione del sonno determinando i meccanismi neurobiologici che controllano la regolazione omeostatica del sonno. Così le mosche private del sonno hanno dimostrato di mostrare menomazioni nell'apprendimento e nella memoria6,7,8,9,10,11,12, plasticità strutturale13,14,15, attenzione visiva16, recupero da lesioni neuronali17,18, accoppiamento e comportamenti aggressivi19, 20, proliferazione cellulare21e risposte allo stress ossidativo22,23 per citarne alcuni. Inoltre, leindagini sui meccanismi neurobiologici che controllano il sonno di rimbalzo hanno prodotto informazioni critiche sul meccanismo neuronale che costituisce l'omeostato del sonno8,9,23, 24,25,26,27,28,29 . Infine, oltre a rivelare intuizioni fondamentali sulla funzione del sonno negli animali sani, gli studi sulla privazione del sonno hanno anche informato le intuizioni sulla funzione del sonno negli statipatologici 30,31.
Mentre la privazione del sonno è innegabilmente uno strumento potente, con qualsiasi esperimento di privazione del sonno, è importante distinguere i fenotipi che derivano dalla veglia prolungata, da quelli indotti dallo stimolo utilizzato per mantenere sveglio l'animale. La privazione del sonno per privazione della mano o manipolazione delicata, è generalmente considerata come lo standard per la privazione del sonno minimamente dirompente. Qui descriviamo un protocollo per privare il sonno delle mosche usando il Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). Lo SNAP è un dispositivo che fornisce uno stimolo meccanico alle mosche ogni 10 secondi, mantenendo sveglie le mosche inducendo geotaxi negativi (Figura 1). Lo SNAP priva efficacemente le mosche di >98% del sonno notturno, anche nelle mosche con un elevato livello di sonno8,32. Lo SNAP è stato calibrato su mosche sensibili al botto, l'agitazione delle mosche nello SNAP non danneggia le mosche; la privazione del sonno con lo SNAP induce un rimbalzo paragonabile a quello ottenuto dalla privazione della mano7. Lo SNAP è quindi un metodo robusto per privare le mosche del sonno mentre controlla gli effetti dello stimolo eccitante.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Locomotor activity tubes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissue Prep Wax</td><td>Thermo Fisher</td><td>13404-122</td><td>Wax used for sealing tubes</td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>Wale Apparatus</td><td>244050</td><td>We cut 5mm diameter Pyrex glass&amp;nbsp;tubes into 65mm long tubes&amp;nbsp;to record sleep. Pre-cut tubes&amp;nbsp;can also be purchased.</td></tr><tr><td>Nutri Fly Bloomington Formulation fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-113</td><td>Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.</td></tr><tr><td>Rotary glass cutting tool</td><td>Dremel Multi Pro</td><td>395</td><td>Used to cut 65mm long glass tubes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Monitoring Sleep&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAM System and DAMFileScan software</td><td>Trikinetics</td><td></td><td>Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format</td></tr><tr><td>Data acquisition computer</td><td>Lenovo</td><td>Idea Centre AIO3</td><td>A equivalent computer from any manufacturer can substitute</td></tr><tr><td>Drosophila Activity Monitors</td><td>Trikinetics</td><td>DAM2</td><td>These monitors are used to record flies&#039; locomotor activity</td></tr><tr><td>Environment Monitor</td><td>Trikinetics</td><td>DEnM</td><td>Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded</td></tr><tr><td>Light Controller</td><td>Trikinetics</td><td>LC4</td><td>A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off</td></tr><tr><td>Power Supply Interface Unit for DAM</td><td>Trikinetics</td><td>PSIU-9</td><td>Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data</td></tr><tr><td>RJ11 connector</td><td>7001-64PC</td><td>Multicomp</td><td>DAM monitors accept RJ11 jacks</td></tr><tr><td>Splitters</td><td>Trikinetics</td><td>SPLT5</td><td>Used to connect upto 5 DAM monitors</td></tr><tr><td>Telephone cable wire</td><td>Radioshack</td><td>278-367</td><td>Phone cables to acquire data from DAM monitors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sleep Deprivation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Gw INSTEK</td><td>GPS-30300</td><td>Power supply for the SNAP</td></tr><tr><td>Sleep Nullifying Apparatus</td><td>Washington University School of Medicine machine shop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila

L'omeostasi del sonno, l'aumento del sonno osservato dopo la perdita di sonno, è uno dei criteri di definizione utilizzati per identificare il sonno in tutto il regno animale. Di conseguenza, la privazione del sonno e la restrizione del sonno sono strumenti potenti che sono comunemente usati per fornire informazioni sulla funzione del sonno. Tuttavia, gli esperimenti di privazione del sonno sono intrinsecamente problematici in quanto lo stimolo di privazione stesso può essere la causa dei cambiamenti osservati nella fisiologia e nel comportamento. Di conseguenza, le tecniche di privazione del sonno di successo dovrebbero mantenere gli animali svegli e, idealmente, provocare un robusto rimbalzo del sonno senza indurre anche un gran numero di conseguenze indesiderate. Qui, descriviamo una tecnica di privazione del sonno per Drosophila melanogaster. Lo Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) somministra uno stimolo ogni 10 secondi per indurre geotaxi negativi. Sebbene lo stimolo sia prevedibile, lo SNAP previene efficacemente >95% del sonno notturno anche nelle mosche con un elevato calo del sonno. È importante sottolineare che la successiva risposta omeostatica è molto simile a quella ottenuta utilizzando la privazione della mano. I tempi e la spaziatura degli stimoli possono essere modificati per ridurre al minimo la perdita di sonno e quindi esaminare gli effetti non specifici dello stimolo sulla fisiologia e sul comportamento. Lo SNAP può essere utilizzato anche per la restrizione del sonno e per valutare le soglie di eccitazione. Lo SNAP è una potente tecnica di interruzione del sonno che può essere utilizzata per comprendere meglio la funzione del sonno.

Il Canton S (Cs) è stato utilizzato come ceppo selvatico. Le mosche sono state mantenute su una luce di 12 ore: 12 ore di buio e sonno privato per 12 ore durante la notte. L'ispezione dei profili del sonno delle mosche Cs nel giorno di base (bs), nel giorno di privazione del sonno (sd) e in due giorni di recupero (rec1 e rec2)(Figura 2A)suggerisce che le mosche sono state effettivamente private del sonno nello SNAP e hanno recuperato il sonno durante il gior...

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The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

La privazione del sonno è un potente strumento per studiare la funzione e la regolazione del sonno. Descriviamo un protocollo per privare di sonno Drosophila usando l'apparato annullante del sonno e per determinare l'entità del sonno di rimbalzo indotto dalla privazione.

L'apparato che annulla il sonno: un metodo altamente efficiente per privare la drosophila del sonno

Sleep homeostasis, the increase in sleep observed following sleep loss, is one of the defining criteria used to identify sleep throughout the animal ...

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Neuroscience

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

3.3K Views.  Washington University School of Medicine. La privazione del sonno è un potente strumento per studiare la funzione e la regolazione del sonno. Descriviamo un protocollo per privare di sonno Drosophila usando l'apparato annullante del sonno e per determinare l'entità del sonno di rimbalzo indotto dalla privazione.

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Ricerca

Neuroscienze

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Immunologia e infezioni

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Comportamento

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian clock modulates alcohol sensitivity, but not the formation of tolerance. Here, we describe our protocol in detail. Alcohol is administered to the flies using the FlyBar. In this setup, saturated alcohol vapor is mixed with humidified air in set proportions, and administered to the flies in four tubes simultaneously. Flies are reared under standardized conditions in order to minimize variation between the replicates. Three-day old flies of different genotypes or treatments are used for the experiments, preferably by matching flies of two different time points (e.g., CT 5 and CT 17) making direct comparisons possible. During the experiment, flies are exposed for 1 hr&#160;to the pre-determined percentage of alcohol vapor and the number of flies that exhibit the Loss of Righting reflex (LoRR) or sedation are counted every 5 min. The data can be analyzed using three different statistical approaches. The first is to determine the time at which 50% of the flies have lost their righting reflex and use an Analysis of the Variance (ANOVA) to determine whether significant differences exist between time points. The second is to determine the percentage flies that show LoRR after a specified number of minutes, followed by an ANOVA analysis. The last method is to analyze the whole times series using multivariate statistics. The protocol can also be used for non-circadian experiments or comparisons between genotypes.

Drosophila has emerged as a significant model system for dissecting the cellular and molecular underpinnings of behavioral responses to alcohol. Here we present a protocol for the collection of alcohol sensitivity data in a circadian context that can be easily applied to other experiments and is well-suited for undergraduate research.

Flybar: Amministrazione alcol a Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Metodo ad alta velocità effettiva per la misurazione del tempo di sedazione alcolica del melanogaster di Drosophila individuale

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but effective method to observe and document the behavior or morphology of flies. Flies were placed in a translucent observation chamber c.a. &#216;15 x 5mm (no food inside) or &#216;15 x 12 mm (with an 8 mm-high piece of food inside). After covering with an ultraviolet (UV)/clear filter with high light transmittance, the chamber was placed under a 5-50x zoom stereo microscope, and mini light-emitting diode (LED) video lights were placed on both sides of the microscope to illuminate the chamber to obtain uniform, soft, bright, and nearly shadow-free light. Then, a compact digital camera with 3-5x optical zoom, which can record 1080 P high-definition or higher resolution video (at a frame rate of &#8805;30 fps), was connected to the eyepiece of microscope through a bracket, and photographs or videos were taken through the eyepiece. By adjusting the zoom knob of the zoom stereo microscope, it was very easy to track the flies and take panoramic or detailed close-up images as needed, while the camera recorded everything under the microscope. Because the flies can stay at any position in the chamber, they can be observed and recorded from all directions. The photographs or videos taken are of good image quality. This method can be used both for scientific research and teaching.

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

This protocol describes how to make a simple adult Drosophila behavior observation chamber, and how to take high-definition photographs/videos of the morphology or behavior of different types of fruit flies in the observation chamber through relatively simple and affordable methods.

Un sistema di imaging ad alta definizione regolabile per studi comportamentali di adulti drosofili

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but ...

Avanzamento dei trattamenti per i disturbi del sonno: un approccio di screening basato sulla drosofila

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders characterized by shortened sleep duration and fragmented patterns. These sleep disruptions also correlate with an increased risk of various illnesses in the elderly, including diabetes, cardiovascular diseases, and psychological disorders. Unfortunately, existing drugs for sleep disorders are associated with significant side effects such as cognitive impairment and addiction. Consequently, the development of new, safer, and more effective sleep disorder medications is urgently needed. However, the high cost and lengthy experimental duration of current drug screening methods remain limiting factors.
This protocol describes a cost-effective and high-throughput screening method that utilizes Drosophila melanogaster, a species with a highly conserved sleep regulation mechanism compared to mammals, making it an ideal model for studying sleep disorders in the elderly. By administering various small compounds to aged flies, we can assess their effects on sleep disorders. The sleep behaviors of these flies are recorded using an infrared monitoring device and analyzed with the open-source data package Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). This protocol offers a low-cost, reproducible, and efficient screening approach for sleep regulation. Fruit flies, due to their short life cycle, low husbandry cost, and ease of handling, serve as excellent subjects for this method. As an illustration, Reserpine, one of the tested drugs, demonstrated the ability to promote sleep duration in elderly flies, highlighting the effectiveness of this protocol.

Autore in primo piano: Superare le sfide nella misurazione del sonno della Drosophila utilizzando il sistema DAM 

Presented is a protocol for high-throughput drug screening to improve sleep by monitoring the sleep behavior of fruit flies in an elderly Drosophila model.

Screening farmacologico di piccole molecole ad alto rendimento per i disturbi del sonno legati all'età utilizzando Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

L'apparato che annulla il sonno: un metodo altamente efficiente per privare la drosophila del sonno

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato

Flybar: Amministrazione alcol a Flies

Metodo ad alta velocità effettiva per la misurazione del tempo di sedazione alcolica del melanogaster di Drosophila individuale

Un sistema di imaging ad alta definizione regolabile per studi comportamentali di adulti drosofili

Screening farmacologico di piccole molecole ad alto rendimento per i disturbi del sonno legati all'età utilizzando Drosophila melanogaster

Screening farmacologico di piccole molecole ad alto rendimento per i disturbi del sonno legati all'età utilizzando Drosophila melanogaster

Screening farmacologico di piccole molecole ad alto rendimento per i disturbi del sonno legati all'età utilizzando Drosophila melanogaster