Accumulo e distribuzione di microplastiche fluorescenti nelle prime fasi della vita del pesce zebra. Introduzione. Il bioaccumulo delle microplastiche svolge un ruolo chiave nei loro effetti tossici. Tuttavia, come particolato, i loro bioaccumulamenti sono diversi da molti altri inquinanti.
Descritto qui è un metodo fattibile per determinare visivamente l'accumulo e la distribuzione di microplastiche negli embrioni di zebrafish o larve utilizzando microplastiche fluorescenti. Gli esperimenti sono stati condotti nel rispetto della guida nazionale Guida di laboratorio linee guida per gli animali per la revisione etica del benessere degli animali. Uno, la raccolta degli embrioni.
I pesci zebra adulti provengono dal China Zebrafish Resource Center. I pesci vengono mantenuti in serbatoi di vetro da 20 litri con sistema di acqua del rubinetto filtrata a carbone a temperatura costante, vale a dire, 28 Gradi Celsius, su un fotoperiodo di 14 e 10 ore, chiaro: scuro. I pesci vengono nutriti due volte al giorno con Artemia nauplii.
Si raccomanda di dare al cibo un peso massimo del 3% per il pesce al giorno e di mangiarlo entro cinque minuti ogni volta. Il pesce zebra adulto ben sviluppato viene trasferito nel serbatoio di deposizione delle uova con un rapporto tra un maschio e due femmine la notte prima dell'allevamento. La mattina seguente, il pesce inizia a deporre le uova dopo l'inizio del ciclo leggero.
Le uova vengono raccolte utilizzando una pipetta Pasteur, risciacquate più volte con la soluzione del 10%Hank e quindi controllate per la fecondazione al microscopio. Le uova fecondate subiscono il periodo di scissione dopo circa due ore dopo la fecondazione e possono essere chiaramente identificate. Gli embrioni fecondati vengono incubati in un bicchiere da 500 millilitri contenente 200 millilitri della soluzione del 10% di Hank con 1%blu di metilene per la disinfezione a 28 Gradi Celsius.
La velocità di carico non supera un embrione in ogni soluzione da 2 millilitri. Due, preparazione di sospensioni in microplastica. La soluzione stock di perline di polistirolo verdi etichettate fluorescentmente con diametro nominale di 500 nanometri viene sonicata per 10 minuti.
Diluire la soluzione stock con la soluzione del 10% Hank per produrre le soluzioni di esposizione desiderate, vale a dire 0,1, 1 e 10 milligrammi per litro. Le soluzioni di esposizione delle microplastiche vengono sempre preparate al momento prima dell'esposizione. Tre, esposizione alla microplastica.
Sei embrioni appena fecondati vengono selezionati casualmente e quindi trasferiti in ogni pozzo di sei piastre contenenti cinque millilitri di soluzioni di microplastica con concentrazioni diverse. Sono inclusi i gruppi di controllo contenenti la soluzione del 10%Hank. I pozzi triplicati, con un totale di 18 embrioni, vengono utilizzati per ogni trattamento.
Gli embrioni vengono incubati sotto lo stesso ciclo e temperatura luce-buio degli adulti e vengono osservati ogni 12 ore. I morti vengono rimossi immediatamente. Le soluzioni in microplastica vengono rinnovate al 90% ogni 24 ore.
Durante il periodo di esposizione, il pesce non viene nutrito. Generalmente, la schiusa dell'embrione inizia a 48 ore dopo la fecondazione e si completa a circa 72 ore dopo la fecondazione. Quattro, valutazione della distribuzione della microplastica.
A 24-48-72-96-e 120 ore dopo la fecondazione, gli embrioni e le larve, uno per ciascuno dei tre replicati, vengono selezionati casualmente e risciacquati con la soluzione del 10% Hank. Gli embrioni e le larve sono disposti e preparati per l'osservazione. In anticipo, le larve vengono trasferite in una piastra di Petri ed esposte allo 0,016% di tricaina per l'anestesia.
I pesci sono osservati con microscopio a fluorescenza e immagini con software di imaging. L'intensità della fluorescenza nei pesci è ulteriormente quantificata con ImageJ NIH. Risultati rappresentativi.
Nei risultati viene mostrato che le microplastiche possono bioaccumulare in embrioni di zebrafish e larve in modo dipendente dalla concentrazione. Prima della schiusa, si trova una forte fluorescenza intorno al coro embrionale;mentre nelle larve di pesce zebra, il sacco vitellino, il pericardio e il tratto gastrointestinale sono i principali siti accumulati di microplastiche. discussione. Questo risultato farà progredire la nostra comprensione della tossicità delle microplastiche per i pesci, e il metodo qui descritto può potenzialmente essere generalizzato per determinare l'accumulo e la distribuzione di altri tipi di materiali fluorescenti nelle prime fasi di vita del pesce zebra.
Poiché il corore fungerà da barriera efficace contro le particelle di grandi dimensioni, il processo di dechorionation prima che possa essere necessaria l'esposizione. Tuttavia, l'embrione con corone intatto è più raccomandato per valutare l'ecotossicità degli inquinanti quando si considerano le condizioni di esposizione nel mondo reale. Anche il comportamento delle microplastiche nella soluzione è fondamentale per la biodisponibilità.
Le caratteristiche fisicochimiche delle microplastiche devono essere tracciate per tutta la durata dell'esposizione.
