Akkumulation und Verteilung von fluoreszierenden Mikroplastik in den frühen Lebensstadien von Zebrafischen. Einleitung. Die Bioakkumulation von Mikroplastik spielt eine Schlüsselrolle bei ihrer toxischen Wirkung. Als Feinstaub unterscheiden sich ihre Bioakkumulationen jedoch von vielen anderen Schadstoffen.
Hier wird eine praktikable Methode beschrieben, um die Ansammlung und Verteilung von Mikroplastik in Zebrafischembryonen oder Larven mit fluoreszierenden Mikroplastiken visuell zu bestimmen. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem nationalen Leitfaden für Labortiere zur ethischen Überprüfung des Tierschutzes durchgeführt. Eine, Embryo-Sammlung.
Erwachsene Zebrafische stammen aus dem China Zebrafish Resource Center. Fische werden in 20-Liter-Glastanks mit umlaufendem, mit Holzkohle gefiltertem Leitungswassersystem bei konstanter Temperatur, nämlich 28 Grad Celsius, auf einer Photoperiode von 14 und 10 Stunden, hell: dunkel gehalten. Fische werden zweimal täglich mit Artemia nauplii gefüttert.
Es wird empfohlen, dass das Essen mit einem Fischgewicht von maximal 3 % pro Tag verabreicht wird und jedes Mal innerhalb von fünf Minuten gegessen werden sollte. Gut entwickelte erwachsene Zebrafische werden in der Nacht vor der Zucht im Verhältnis von einem Männchen zu zwei Weibchen in den Laichbecken gebracht. Am nächsten Morgen beginnen die Fische nach dem Beginn des Lichtzyklus zu laichen.
Die Eier werden mit einer Pasteurpipette gesammelt, mehrmals mit 10%Hanks Lösung gespült und dann mit einem Mikroskop auf Befruchtung überprüft. Befruchtete Eier durchlaufen die Spaltungszeit nach etwa zwei Stunden nach der Befruchtung und können eindeutig identifiziert werden. Die befruchteten Embryonen werden in einem 500-Milliliter-Becher mit 200-Milliliter 10%Hank-Lösung mit 1%Methylenblau zur Desinfektion bei 28 Grad Celsius inkubiert.
Die Laderate beträgt nicht mehr als einen Embryo in jeder 2-Milliliter-Lösung. Zweitens, Herstellung von Mikroplastiksuspensionen. Die Stammlösung aus grünen fluoreszierend markierten Polystyrolperlen mit einem Nenndurchmesser von 500 Nanometern wird 10 Minuten lang beschallt.
Verdünnen Sie die Lagerlösung mit 10%Hanks Lösung, um die gewünschten Belichtungslösungen zu produzieren, nämlich 0,1, 1 und 10 Milligramm pro Liter. Die Belichtungslösungen von Mikroplastik werden vor der Exposition immer frisch zubereitet. Drei Mikroplastik-Exposition.
Sechs neu befruchtete Embryonen werden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und dann in jeden Brunnen von sechs Brunnenplatten mit fünf Milliliter mikroplastischen Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen übertragen. Die Kontrollgruppen, die die Lösung von 10% Hank enthalten, sind enthalten. Für jede Behandlung werden dreifache Brunnen mit insgesamt 18 Embryonen verwendet.
Die Embryonen werden unter dem gleichen hell-dunklen Zyklus und der gleichen Temperatur wie Erwachsene inkubiert und alle 12 Stunden beobachtet. Die Toten werden sofort entfernt. Die Mikroplastiklösungen werden alle 24 Stunden zu 90% erneuert.
Während der Expositionsphase werden die Fische nicht gefüttert. Im Allgemeinen beginnt das Schlüpfen des Embryos bei 48 Stunden nach der Befruchtung und endet bei etwa 72 Stunden nach der Befruchtung. Viertens, Bewertung der Mikroplastikverteilung.
Bei der 24-48-72-96-und 120-stündigen Nachbefruchtung werden die Embryonen und Larven, jeweils einer aus den drei Repliken, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und mit 10%Hanks Lösung ausgerinnt. Die Embryonen und Larven werden angeordnet und zur Beobachtung vorbereitet. Zuvor werden die Larven in eine Petrischale überführt und 0,016% Tricain zur Anästhesie ausgesetzt.
Die Fische werden mit dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet und mit Bildgebungssoftware abgebildet. Die Fluoreszenzintensität bei Fischen wird mit ImageJ NIH weiter quantifiziert. Repräsentative Ergebnisse.
In den Ergebnissen zeigt sich, dass Mikroplastik in Zebrafischembryonen und Larven konzentrationsabhängig bioakkumuliert werden kann. Vor dem Schlüpfen findet sich eine starke Fluoreszenz um die embryonale Chorion; während bei Zebrafischlarven der Dottersack, das Perikard und der Magen-Darm-Trakt die hauptakkumulierten Stellen von Mikroplastik sind. Diskussion. Dieses Ergebnis wird unser Verständnis über die Toxizität von Mikroplastik für Fische fördern, und die hier beschriebene Methode kann potenziell verallgemeinert werden, um die Ansammlung und Verteilung anderer Arten von fluoreszierenden Materialien in den frühen Lebensphasen von Zebrafischen zu bestimmen.
Da die Chorion als wirksame Barriere gegen die Partikel mit großer Größe wirkt, kann der Dechorionierungsprozess vor der Exposition erforderlich sein. Jedoch, der Embryo mit Chorion intakt wird eher empfohlen, um die Ökotoxizität von Schadstoffen zu bewerten, wenn der Zustand der Exposition in der realen Welt zu bewerten. Das Verhalten von Mikroplastik in der Lösung ist auch für die Bioverfügbarkeit entscheidend.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Mikroplastik sollten über die Expositionsdauer nachverfolgt werden.
