Acumulação e distribuição de microplásticos fluorescentes nos estágios iniciais da vida dos zebrafish. Introdução. A bioacúsculação de microplásticos desempenha um papel fundamental em seus efeitos tóxicos. No entanto, como partículas, suas bioacúsculas são diferentes de muitos outros poluentes.
Descrito aqui é um método viável para determinar visualmente o acúmulo e distribuição de microplásticos em embriões de zebrafish ou larvas usando microplásticos fluorescentes. Os experimentos foram realizados em conformidade com a orientação nacional Do Laboratório de Orientação animal para revisão ética do bem-estar animal. Um, coleção de embriões.
Os zebrafish adultos são originários do Centro de Recursos de Zebrafish da China. Os peixes são mantidos em tanques de vidro de 20 litros com sistema de água filtrada por carvão recirculando a uma temperatura constante, ou seja, 28 graus Celsius, em um fotoperiodo de 14 e 10 horas, claro:escuro. Os peixes são alimentados duas vezes por dia com Artemia nauplii.
Recomenda-se que o alimento seja dado no máximo 3% de peso de peixe por dia, e deve ser comido em até cinco minutos todas as vezes. Zebrafish adultos bem desenvolvidos são transferidos para o tanque de desova em uma proporção de um macho para duas fêmeas na noite anterior à reprodução. Na manhã seguinte, os peixes começam a desovar após o início do ciclo de luz.
Os ovos são coletados usando uma pipeta Pasteur, enxaguada com a solução de 10% Hank várias vezes, e depois verificada para fertilização usando um microscópio. Os óvulos fertilizados passam pelo período de decote após aproximadamente duas horas após a fertilização pós-fertilização e podem ser claramente identificados. Os embriões fertilizados são incubados em um béquer de 500 mililitros contendo 200 mililitros de solução de 10% Hank com 1%de azul de metileno para desinfecção a 28 graus Celsius.
A taxa de carregamento não excede um embrião em cada solução de 2 mililitros. Dois, preparação de suspensões microplásticas. A solução de estoque de contas de poliestireno fluorescente verde com diâmetro nominal de 500 nanômetros são sonicadas por 10 minutos.
Diluir a solução de estoque com a solução de 10% hank para produzir as soluções de exposição desejadas, ou seja, 0,1, 1 e 10 miligramas por litro. As soluções de exposição de microplásticos são sempre preparadas recentemente antes da exposição. Três, exposição microplástica.
Seis embriões recém-fertilizados são selecionados aleatoriamente e, em seguida, transferidos para cada poço de seis placas de poço contendo cinco mililitros de soluções microplásticas com diferentes concentrações. Os grupos de controle contendo a solução de 10% hank estão incluídos. Poços triplicados, com um total de 18 embriões, são utilizados para cada tratamento.
Os embriões são incubados sob o mesmo ciclo claro-escuro e temperatura que os adultos, e são observados a cada 12 horas. Os mortos são removidos imediatamente. As soluções microplásticas são 90% renovadas a cada 24 horas.
Durante o período de exposição, os peixes não são alimentados. Geralmente, a eclosão do embrião começa em 48 horas após a fertilização e é concluída em cerca de 72 horas após a fertilização. Quatro, avaliação da distribuição microplástica.
Na fertilização pós-fertilização de 24-48-72-96 e 120 horas, os embriões e larvas, um de cada uma das três réplicas, são selecionados aleatoriamente e enxaguados com a solução de 10% hank. Os embriões e larvas estão dispostos e preparados para observação. De antemão, as larvas são transferidas para uma placa de Petri, e expostas a 0,016% de tricaine para anestesia.
Os peixes são observados com microscópio de fluorescência, e imageados com software de imagem. A intensidade da fluorescência em peixes é ainda mais quantificada com ImageJ NIH. Resultados representativos.
Mostra-se nos resultados que os microplásticos podem bioacumular em embriões de zebrafish e larvas de forma dependente da concentração. Antes da eclosão, a fluorescência forte é encontrada ao redor do acorde embrionário;enquanto em larvas de peixe zebra, o saco de gema, o pericárdio e o trato gastrointestinal são os principais locais acumulados de microplásticos. discussão. Este resultado avançará nossa compreensão sobre a toxicidade dos microplásticos aos peixes, e o método descrito aqui pode potencialmente ser generalizado para determinar o acúmulo e distribuição de outros tipos de materiais fluorescentes nos estágios iniciais da vida dos zebrafish.
Uma vez que o acorde agirá como uma barreira eficaz contra as partículas de grande porte, o processo de descorção antes da exposição pode ser necessário. No entanto, o embrião com corão intacta é mais recomendado para avaliar a ecotoxicidade dos poluentes quando se considera a condição de exposição no mundo real. O comportamento dos microplásticos na solução também é fundamental para a biodisponibilidade.
As características físico-químicas dos microplásticos devem ser rastreadas ao longo da duração da exposição.
