ゼブラフィッシュの初期段階における蛍光マイクロプラスチックの蓄積と分布紹介。マイクロプラスチックの生体蓄積は、その毒性作用において重要な役割を果たす。しかし、粒子状として、その生物蓄積は他の多くの汚染物質とは異なります。
ここで説明する、ゼブラフィッシュ胚または幼虫におけるマイクロプラスチックの蓄積および分布を蛍光マイクロプラスチックを用いて視覚的に決定する方法である。実験は、動物福祉の倫理的見直しのための国立ガイドライン実験動物ガイドラインに従って行われました。1つは、胚コレクションです。
成虫のゼブラフィッシュは、中国ゼブラフィッシュリソースセンターから生まれました。魚は、14時間と10時間、明暗の光周期で、一定の温度、すなわち28°Cの度で炭濾過された水道水システムを再循環させる20リットルのガラスタンクに維持されます。魚はアルテミアナウプリイと一日2回供給されます。
1日あたり最大3%の魚の体重で食べ物を与え、毎回5分以内に食べるべきであることをお勧めします。よく発達した成虫ゼブラフィッシュは、繁殖前夜に1匹の雄と2匹のメスの比率で産卵タンクに移されます。翌朝、魚は光サイクルの発症後に産卵し始めます。
卵はパスツールピペットを使用して採取し、10%Hankの溶液を数回リンスし、顕微鏡で受精をチェックします。受精卵は約2時間後の切断期間を経て、明確に同定することができる。受精胚は、200ミリリットルのハンク溶液を含む500ミリリットルのビーカーで、1%メチレンブルーで28°Cの度で消毒する。
積載速度は、各2ミリリットル溶液において1つの胚を超えていない。2つは、マイクロプラスチック懸濁液の調製。500ナノメートルの名目直径を持つ緑色の蛍光標識ポリスチレンビーズのストック溶液は10分間超音波処理されます。
10%ハンクの溶液でストック溶液を希釈し、必要な露出溶液、すなわち0.1、1、10ミリグラム/リットルを生成します。マイクロプラスチックの露光液は、常に露光前に新たに調製されます。3つの、マイクロプラスチック暴露。
6つの新しく受精した胚を無作為に選択し、その後、異なる濃度のマイクロプラスチック溶液の5ミリリットルを含む6つのウェルプレートの各ウェルに移管される。10%Hankの溶液を含む対照群が含まれています。3重化井戸は、合計18個の胚を有し、各治療に使用される。
胚は成人と同じ明暗サイクルと温度でインキュベートされ、12時間ごとに観察される。死者はすぐに取り除かれます。マイクロプラスチックソリューションは、24時間ごとに90%更新されます。
暴露期間中、魚は餌を与えられていない。一般的に、胚の孵化は受精後48時間から始まり、受精後約72時間で完了する。4つは、マイクロプラスチック分布の評価。
24-48-72-96-および120時間の受精後に、3つの複製のそれぞれから1つずつ、胚および幼虫が無作為に選択され、10%ハンクの溶液ですすがされる。胚と幼虫は、観察のために配置され、準備されています。幼虫はペトリ皿に移され、麻酔のために0.016%トリカインにさらされます。
この魚は蛍光顕微鏡で観察され、イメージングソフトウェアでイメージングされます。魚の蛍光強度は、さらにImageJ NIHで定量化されます。代表結果。
マイクロプラスチックは、濃度依存的な方法でゼブラフィッシュ胚および幼虫に生物蓄積できることを結果で示した。孵化前に、強い蛍光が胚絨毛の周りに見られ、シマウマの魚の幼虫では、黄身嚢、心膜、および胃腸管がマイクロプラスチックの主な蓄積部位である。議論。この結果は、魚に対するマイクロプラスチックの毒性に関する我々の理解を進め、ここで説明する方法は、ゼブラフィッシュの初期段階における他の種類の蛍光物質の蓄積と分布を決定するために一般化される可能性がある。
絨毛は大きなサイズの粒子に対する効果的なバリアとして機能するので、露出前のデコールリオネーションプロセスが必要になる可能性があります。しかし、絨毛膜をそのままにした胚は、現実世界での暴露の状態を考慮する際に汚染物質の生態毒性を評価するためにより推奨される。ソリューション内のマイクロプラスチックの挙動は、バイオアベイラビリティにも重要です。
マイクロプラスチックの物理化学的特性は、暴露期間にわたって追跡する必要があります。
