È difficile valutare la funzione del sarcomero nei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali a causa del loro sarcomero sottosviluppato e disorganizzato. Utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti, ora possiamo accedere all'accorciamento del sarcomero. Possiamo visualizzare i sarcomer e valutare la loro funzione in vitro utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali e proteine sarcomere con tag fluorescenti.
Utilizzando la trasduzione basata su AAV, possiamo espandere il metodo a qualsiasi cellula staminale pluripotente indotta derivata dal paziente. Questo metodo può essere esteso allo sviluppo della terapia della cardiomiopatia, in quanto può essere utilizzato per valutare direttamente la disfunzione sarcomere correlata alla malattia in vitro. Questo metodo è utile nel campo della cardiologia, incluso lo studio di cardiologia pediatrica.
Tuttavia, può anche essere applicato allo studio della disfunzione muscolare scheletrica, come la miopatia. Il giorno meno quattro di induzione di differenziazione, rivestire una piastra a sei porri con 0,5 microgrammi per centimetro quadrato di laminina-511 E8 diluita in PBS per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Verso la fine dell'incubazione, trattare le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo con tripsidenza ricombinante per tre minuti a 37 gradi Celsius.
Quando le cellule si sono staccate, raccogliere le cellule a medio integrato con il 10%FBS per il conteggio e rimescolare le cellule a un inibitore 1,25 volte 10 alla quinta cella per due millilitri di mezzo AK02N integrato con laminina-511 E8 e inibitore ROCK dopo la centrifugazione. Successivamente, aspirare la soluzione di rivestimento da ogni pozzo della piastra a sei pozzi e seminare due millilitri di cellule in ogni pozzo. Riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare.
Dopo quattro giorni, le celle raggiungono l'80% di confluenza. Sostituire il supernatante in ogni pozzo con due millilitri di RPMI più B27 senza mezzo di insulina integrato con inibitore GSK-3 per pozzo per indurre la differenziazione. Dopo due giorni di differenziazione, sostituire delicatamente il mezzo con due millilitri di RPMI più B27 senza mezzo di insulina integrato con inibitore dell'istrice per pozzo.
Le celle avrebbero dovuto raggiungere la confluenza al 100%. Il quarto giorno di differenziazione, sostituire delicatamente i supernatanti con due millilitri di RPMI più B27 senza insulina per pozzo. Le cellule dovrebbero rimanere ad alta densità, e alcune potrebbero aver iniziato a galleggiare.
Il settimo e il nove giorno di differenziazione, sostituire il supernatante in ogni pozzo con due millilitri di RPMI più B27 con insulina integrata con puromicina per la coltura cardiomiocitaria pluripotente selettiva derivata dalle cellule staminali. A questo punto, le cellule che battono dovrebbero essere osservate all'interno delle colture. Per impostare una coltura di cardiomiociti pluripotente con pattern, utilizzare prima il nastro adesivo per rimuovere qualsiasi polvere dalla superficie di un timbro PDMS su misura e immergere brevemente il timbro nel 70% di etanolo.
Utilizzare uno spolverino d'aria per rimuovere l'etanolo dalla superficie del timbro e trattare la superficie con da cinque a 10 microlitri di polimero ed etanolo 0,5%MPC. Quando il polimero si è completamente asciugato, posizionare il timbro su un coprisciuga polimerico in un piatto di imaging da 35 millimetri e posizionare un peso sul timbro. Dopo 10 minuti, utilizzare un microscopio a luce per confermare che il motivo è stato trasferito sul copripavimenti e lavare il piatto e il coverslip due volte con PBS.
Dopo il secondo lavaggio, rivestire il coverslip con 0,5 a un microgrammo per centimetro quadrato di laminina-511 E8 diluito in gelatina allo 0,1% per un'incubazione da due a quattro ore a temperatura ambiente. Il giorno 10 di differenziazione, lavare le cellule due volte con PBS, seguito da un trattamento con un millilitro di tripina ricombinante per pozzo per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo il conteggio, rimostrare le cellule a un 2,5-5 per 10 alla quinta cellule per millilitro di RPMI più B27 con insulina integrata con concentrazione di puromicina e seminare un millilitro di cellule sulla piastra per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.
La mattina seguente, sostituire il supernatante con RPMI fresco più B27 con insulina integrata con puromicina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare, rinfrescando il mezzo da due a tre volte a settimana fino ai giorni da 21 a 28 per l'imaging. Per l'imaging time-lapse dell'accorciamento del sarcomero nelle colture PCCSM, applicare l'olio sulla lente 100 volte obiettiva di un microscopio confocale fluorescente e selezionare le condizioni di imaging dal vivo nel software associato. Per ottenere dati rappresentativi affidabili, selezionare la frequenza fotogrammi più elevata, impostare l'otturatore in modo che si apra e applicare un binning quattro per quattro in un ritaglio dell'area di acquisizione per ottenere gli intervalli più brevi tra le immagini durante l'imaging time-lapse.
Se la velocità di battiaggio delle cellule è bassa, evocare le cellule mediante stimolazione del campo elettrico e avviare la registrazione time-lapse, facendo attenzione che il campo immaginato rimanga a fuoco durante l'imaging. Alla fine del periodo di imaging, salvare le immagini time-lapse in una cartella appropriata. Per analizzare le immagini time-lapse, aprire una serie di immagini time-lapse in ImageJ e regolare la luminosità e il contrasto delle immagini fino a quando il modello di sarcomere non può essere chiaramente osservato.
Nel menu Altri strumenti selezionare SarcOptiM e premere Ctrl MAIUSC P e un pulsante micron sulla barra degli strumenti per utilizzare le istruzioni per calibrare il programma. Quindi tracciare una linea attraverso la regione del sarcomero da utilizzare per misurare l'accorciamento del sarcomero, quindi fare clic su AVI a cella singola per iniziare l'analisi di accorciamento del sarcomero. L'imaging time-lapse di cardiomiociti pluripotenti con etichetta sarcomere e modellati può essere utilizzata per misurare l'accorciamento del sarcomero in diversi punti di tempo.
Per superare la disorganizzazione del sarcomero tipicamente osservata nelle colture di cardiomiociti pluripotenti a cellule staminali modellate, specifici timbri PDMS possono essere utilizzati per colturare cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali modellati in un modello a strisce, che promuove una forma cellulare allungata e un modello di sarcomero più organizzato rispetto alle cellule coltivate in un'area non modello. Le colture modellate promuovono anche una migliore contrazione cellulare e forniscono un profilo di lunghezza del sarcomero liscio rispetto alle cellule coltivate non modello. I cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali aAV esprimono segnali sarcomerici GFP lungo i cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali modellati già tre giorni dopo la trasduzione e possono anche essere utilizzati per misurare i profili di contrazione del sarcomero.
Inoltre, l'aggiunta di un gene resistente alla blasticidina durante la trasduzione può anche essere utilizzata per facilitare la selezione di cardiomiociti pluripotenti a modelli derivati dalle cellule staminali a una purezza superiore al 90%Per facilitare un'analisi delle immagini più semplice e di qualità superiore, è essenziale identificare un'area con sarcomeri che si muovono linearmente e ottenere immagini alla massima frequenza fotogrammi. Utilizzando questo metodo, possiamo valutare il ruolo della maturazione nelle proteine sarcoma per studiare la disfunzione sarcomere nel cardiomiocita di laboratorio derivato da cellule iPS specifiche della malattia derivate dal paziente.
