Il protocollo è significativo poiché mostra l'isolamento e la trasfezione di cellule epiteliali pigmentate da cinque mammiferi come un sistema ottimale per studiare la terapia genica oculare in varie configurazioni. Il vantaggio principale di questo metodo è la sua flessibilità, trasferibilità, alta resa cellulare, vitalità e tasso di trasfezione a causa delle cinque specie e del sistema di trasposone SB100X non virale utilizzato. Queste tecniche sono state sviluppate per studiare approcci di terapia genica mirati alle cellule epiteliali pigmentate della retina e dell'iride, che sono isolate e trasfettate nel presente protocollo, ma sono utilizzabili per qualsiasi ricerca oculare.
A dimostrare la procedura sarà Gregg Sealy, un tecnico del laboratorio. Dopo l'eutanasia dell'animale, utilizzare forbici curve e pinza Colibri per enucleare gli occhi, quindi pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi. Raccogliere gli occhi in un tubo da 50 millilitro riempito con PBS non sterile e trasferire il tubo nella cappa a flusso laminare.
Disinfettarli immergendoli in una soluzione a base di iodio per due minuti, quindi trasferire gli occhi in un tubo da 50 millilitro riempito con PBS sterile. Metti un occhio su una garza sterile e tieni saldamente l'occhio vicino al nervo ottico. Quindi tagliare vicino al limite dell'iride con un bisturi numero 11.
Usando le forbici, tagliare intorno all'iride e rimuovere il segmento anteriore e metterlo in una capsula di Petri, lasciando il bulbo con il vitreo fino a quando l'epiteliale pigmentato retinico, o cellule RPE, sono isolati. Per isolare l'epiteliale pigmentato dell'iride, o cellule IPE, rimuovere la lente con una pinciglia fine ed estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri e lavarla con PBS sterile.
Aggiungere 500 microlitri di tripsina allo 0,25% e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo e raschiare delicatamente l'IPE con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 millilitro.
Contare le cellule usando la camera neubauer e seminare 0,2 milioni di cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti con un millilitro di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per isolare le cellule RPE, rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinna sottile.
Mettere le lampadine nella piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri da 0,25% di tripsina per occhio e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo per globo e raschiare delicatamente le celle RPE con una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 millilitro.
Contare le cellule usando la camera di Neubauer e seminare le cellule come descritto in precedenza. Posizionare il piatto nell'incubatrice. Pulire il tessuto muscolare e la pelle rimanenti dagli occhi e disinfettare gli occhi in una soluzione a base di iodio e risciacquarli con PBS.
Per isolare le cellule IPE, rimuovere la lente ed estrarre l'iride come descritto in precedenza. Dopo aver preparato due iris, aggiungere un millilitro di mezzo completo e isolare le cellule graffiando con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco, quindi contare e seminare le cellule. Posizionare il piatto nell'incubatrice.
Per isolare le cellule RPE, rimuovere il vitreo e la retina dal segmento posteriore e posizionare il bulbo in una capsula di Petri. Riempire il bulbo con un mezzo completo da un millilitro. Utilizzando una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco, rimuovere le celle RPE.
Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitro per la ricasuspensione. Quindi contare e seminare le cellule e incubare la piastra come precedentemente dimostrato. Dopo la pulizia, aprire l'occhio e tagliare intorno all'iride per rimuovere il segmento anteriore, quindi inserire una capsula di Petri.
Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate. Per isolare le cellule IPE, se la lente viene fornito con il segmento anteriore, rimuovere la lente e utilizzare una pinzo fine per estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri e lavarla con PBS sterile.
Tagliare il corpo ciliare con un bisturi numero 10. Dopo aver preparato le iridi, incubarle con due millilitri di tripsina allo 0,25% a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere la tripsina e aggiungere due millilitri di mezzo completo, quindi isolare le celle graffiando con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da due millilitri e centrifugare le cellule per 10 minuti a 120 volte G.Scartare il surnatante e risospentare le cellule in due millilitri di mezzo completo. Semina 0,32 milioni di cellule per pozzo in una piastra a sei pozzetti in tre millilitri di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Per isolare le cellule RPE, rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinca. Evitare di danneggiare l'epitelio pigmentato retinico. Lavare la lampadina con PBS.
Dopo aver preparato entrambi gli occhi, riempire il bulbo di circa tre quarti pieno di tripsina e incubare per 25 minuti a 37 gradi Celsius con la palpebra della capsula di Petri sulla parte superiore dell'occhio del bulbo. Rimuovere la tripsina e aggiungere un millilitro di mezzo completo. Utilizzando una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco, rimuovere le celle RPE.
Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitro per la ricaspensione. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 120 volte G.Seed 0,32 milioni di cellule per pozzetti in una piastra a sei pozzetti in tre millilitri di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Coltura le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Dopo tre o quattro giorni, pipettare su e giù per raccogliere cellule non aderenti e mettere metà del volume in un altro pozzo. Riempire il pozzo a un millilitro con un mezzo completo.
Dopo altri tre o quattro giorni, ripeti la raccolta delle cellule, questa volta combinando le cellule non aderenti da due pozzeli in uno. Aggiungi medio a tutti i pozzi. Osservare le cellule e cambiare il mezzo due volte a settimana.
Quando le celle raggiungono la confluenza, passare al mezzo completo con l'1% di FBS. Utilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il modello di espressione di RPE è stato confermato nelle cellule IPE bovine primarie mediante immunofluorescenza per RPE65.
La vitalità cellulare è stata studiata per escludere una potenziale tossicità del tampone di elettroporazione utilizzando un kit di analisi della citotossicità disponibile in commercio e un controllo elettroporato del nodo. Non è stato osservato alcun impatto sulla vitalità cellulare. Le cellule epiteliali pigmentate precolturate di diverse specie sono state trasfettate con la proteina Di Venere fluorescente gialla.
Le cellule RPE19 trasfettate sono state utilizzate come controllo positivo. La quantificazione dell'efficienza di trasfezione nell'RPE dei suini precolturati è mostrata qui. Le cellule epiteliali del pigmento di coniglio appena isolate sono state trasfettate con la proteina fluorescente gialla Venere e sono state monitorate al microscopio.
Le cellule epiteliali pigmentate sono state trasfettate con il fattore derivato dall'epitelio pigmentato e la secrezione proteica è stata monitorata da Western blot. Il segnale per le cellule trasfettate era più alto rispetto alle cellule non trasfettate per tutte le specie e i giorni studiati, e non è stata osservata alcuna diminuzione della secrezione proteica entro questo periodo. È fondamentale evitare di raschiare le cellule con strumenti affilati.
Qui vengono utilizzate pipette Pasteur lucidate a fuoco, tranne che nei piccoli occhi di topo, dove deve essere usato un bisturi rotondo. Le cellule epiteliali pigmentate possono essere utilizzate per sviluppare approcci di terapia genica e per simulare condizioni patologiche, ad esempio danni da stress ossidativo. Questi modelli possono anche essere utilizzati per testare farmaci terapeutici.
