L'obiettivo generale di questa procedura è quello di seguire in tempo reale la formazione di proplatelet da megacariociti di topo, che sono maturati nel loro ambiente nativo. Questo metodo ha il vantaggio di essere semplice, riproducibile e veloce. Si possono analizzare molti megacariociti e visualizzare la formazione di proplatelet in sole sei ore, invece di aspettare il primo giorno di coltura come per i megacariociti di topo in vitro.
Un'applicazione interessante di questo metodo è la possibilità di studiare l'effetto del trattamento farmaceutico o della mutazione genetica, in particolare nella fase di estensione del proplatelet. Qui non ci sono interferenze con il processo di differenziazione, come nel caso della coltura in vitro. Questo video aiuta a garantire questi passaggi chiave di lavaggio e taglio del midollo osseo.
Viene anche spiegato come classificare la morfologia e i megacariociti, che è davvero utile per la caratterizzazione dei difetti nella malattia trombofila. Per iniziare, riscaldare il buffer di Tyrode a 37 gradi Celsius e accendere la camera di riscaldamento del microscopio per portare la temperatura a 37 gradi Celsius. Preparare tutti gli strumenti necessari, come un timer, camere di incubazione, siringhe calibro 21 da cinque millilitro, pinna di forza, una lama di rasoio, pipette Pasteur, vetrini e tubo centrifugo da 15 millilitteri.
Lavare il midollo osseo con due millilitri del tampone di Tyrode introducendo un ago calibro 21 nell'apertura del femore sul lato del ginocchio e premere lentamente lo stantuffo per recuperare un cilindro del midollo intatto. Utilizzare una pipetta di plastica da tre minuti per trasferire con cura e delicatezza il midollo osseo intatto su un vetrino. Tagliare le estremità del midollo che potrebbero essere state compresse al momento del risciacquo.
Quindi tagliare sezioni trasversali sottili di spessore di 0,5 millimetri usando una lama di rasoio affilata per evitare di danneggiare i megacariociti. Usando una pipetta di plastica, raccogli 10 sezioni in un tubo di un millilitro contenente il buffer di Tyrode. Trasferire con cura le sezioni in una camera di incubazione con un diametro di 13 millimetri.
Aspirare il tampone e regolare il volume a 30 microlitri del tampone di Tyrode integrato con il 5% di siero di topo. Posizionate le sezioni a distanza. Sigillare la camera autoadesiva con uno slittamento del coperchio di 22 per 55 millimetri, inclinando lo slittamento del coperchio per evitare la formazione di bolle d'aria.
Posizionare la camera nella camera di riscaldamento a 37 gradi Celsius. Avvia il cronometro ed esegui l'esperimento per sei ore a 37 gradi Celsius, realizza video per registrare la trasformazione dei megacariociti. Dopo 30 minuti, le cellule del midollo migrano gradualmente verso la periferia dell'espianto formando un monostrato.
Dopo un'ora di incubazione, i megacariociti possono essere identificati dalle loro grandi dimensioni e dai nuclei polilobulati. Il numero di megacariociti aumenta dopo tre ore di incubazione e alcuni hanno lunghe estensioni. Disegna una mappa per localizzare ogni sezione nella camera di incubazione.
Dopo un'ora, identifica i megacariociti visibili, che sono gigantesche cellule polilobulate alla periferia di ogni sezione, e traccia le loro posizioni sul disegno. Ripetere questa procedura dopo tre e sei ore. I megacariociti vengono contati manualmente e classificati in base alla loro morfologia a tre e sei ore dopo la sigillatura della camera di incubazione.
Sono classificati come piccoli, grandi con intenzione spessa e proplatelet che si estende. Con l'aiuto della mappatura, la loro evoluzione può essere seguita nel tempo. I risultati sono espressi come percentuale di ogni classe in ogni momento di osservazione.
Classicamente, la metà dei megacariociti visibili alla periferia estende i proplatelet a sei ore per il midollo osseo di topo selvatico. Il destino dei megacariociti rotondi è stato seguito dalla cattura di immagini sequenziali nel tempo per immaginare come formano i proplatelet. Una cosa importante da ricordare quando si tenta questa procedura è mantenere gli espianti a 37 gradi Celsius per tutta la durata dell'esperimento.
Una temperatura diversa può cambiare i risultati. È interessante notare che il protocollo di espianto può essere utilizzato dopo esperimenti di microscopia introversa. Alla fine i megacariociti negli espianti del midollo osseo saranno naturalmente fluorescenti e il loro comportamento può essere facilmente studiato.
Ciò consente di combinare trattamenti diversi sugli stessi animali e quindi ridurre il numero di topi. In conclusione, il metodo di espianto è veloce, semplice e fornisce molte informazioni sulla capacità dei megacariociti naturali alle propilature esterne. I risultati qualitativi e quantitativi risultanti sono la chiave per la nostra comprensione della malattia trombofila.
in un contesto fisiologico o patologico.
