Questo protocollo incoraggia l'uso di tessuti umani primari come modello clinicamente rilevante per la ricerca sull'osteoartrite. L'esecuzione di analisi di espressione genica e istologica in questi tessuti può fornire nuove intuizioni meccanicistiche. Questa tecnica standardizza i metodi per l'identificazione e l'elaborazione dei componenti dell'articolazione del ginocchio umano.
Consente l'estrazione di RNA di alta qualità che soddisfa i requisiti per i saggi di espressione genica a valle. È difficile ottenere RNA di alta qualità da tessuti articolari malati, quindi l'importanza di passaggi apparentemente insignificanti, come mantenere tutto pulito e fresco, non deve essere sottovalutata. A dimostrare la procedura saranno Thomas Wilson, un ricercatore associato e Navdeep Kaur, un borsista post-dottorato del mio laboratorio.
Inizia identificando i tessuti duri, tra cui cartilagine, ossa e menisco e tessuti molli, tra cui cuscinetto di grasso infrapatellare, legamento crociato anteriore, sinovia e vasto muscolo obliquo mediale dal campione in base alle differenze di dimensioni, forma, colore e consistenza. Tagliare ciascuno dei tessuti in tre sezioni. Risciacquare le sezioni di tessuto con PBS sterile per rimuovere eventuali residui o detriti.
Per l'estrazione dell'RNA, tagliare ciascuna delle tre sezioni di tessuto in cubi di circa uno o due millimetri. Trasferire i pezzi più piccoli in un flaconcino crio da due millilitro. Dopo aver fissato saldamente i tappi, congelare le fiale immergendo in azoto liquido per 30 secondi, quindi trasferire la fiala nel congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine e ripetere questa procedura per tutti i tessuti.
Omogeneizzare il tessuto duro usando un mortaio e un pestello. Prima dell'omogeneizzazione, raffreddare il mortaio, il pestello e la spatola usando azoto liquido per evitare che il campione si scongeli. Elaborare un solo campione alla volta.
Trasferire il campione di tessuto sulla malta usando una spatola refrigerata. Versare azoto liquido sulla parte superiore del tessuto. Dopo che l'azoto liquido evapora, schiacciare il tessuto con un pestello.
Aggiungere ripetutamente azoto liquido durante la macinazione del tessuto per ottenere polvere di tessuto fine. Trasferire la polvere di tessuto fine in un tubo di microcentrghiera da 1,5 millilitro pre-refrigerato immergendolo in azoto liquido per 30 secondi. Aggiungere un millilitro della soluzione di fenolo di guanidinio acido ghiacciato a ciascun tubo e incubare i tubi sul ghiaccio per 20 minuti.
Prima di omogeneizzare diversi tessuti duri, pulire accuratamente il mortaio, il pestello e la spatola con etanolo al 70%, quindi con decontaminante RNasi, seguito da acqua trattata DEPC. Immergere il mortaio, il pestello e la spatola in etanolo al 70%, quindi pulire qualsiasi liquido residuo con un tessuto pulito e privo di lanugine. Omogeneizzare i tessuti molli utilizzando l'omogeneizzatore tissutale.
Per disinfettare l'omogeneizzatore, lavare la sonda facendo scorrere tubi di etanolo al 70% e decontaminante RNasi per 30 secondi per lavaggio, quindi lavare con acqua trattata DEPC, seguita da un ulteriore 70% di etanolo, ciascuno per 30 secondi. Pulire qualsiasi liquido residuo con un tessuto pulito e privo di lanugine. Aggiungere un millilitro di soluzione acida di guanidinio fenolo a cinque tubi a fondo tondo pre-etichettati e trasferire il campione di tessuto nel tubo.
Posizionare il tubo su ghiaccio durante tutta la procedura e omogeneizzare il tessuto per un massimo di cinque impulsi 32 o fino a quando il tessuto non è visivamente disciolto. Incubare il tessuto omogeneizzato sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni di tessuto non vengono elaborati. Disinfettare e pulire l'omogeneizzatore prima di elaborare il campione di tessuto successivo.
Utilizzando una pinca sterile, rimuovere qualsiasi pezzo di tessuto presente nei denti della sonda. Incubare tutto il tessuto omogeneizzato sul ghiaccio per altri 20 minuti e quindi trasferire il campione di tessuto in un tubo di microcentro da 1,5 millilitri pre-etichettato e pre-refrigerato. Sette tessuti unici dell'articolazione del ginocchio umano ottenuti da pazienti con osteoartrite sono stati elaborati entro quattro ore dalla rimozione chirurgica.
I tessuti sono stati identificati visivamente e confermati dalla colorazione istologica H&E. Le sezioni di tessuto duro colorate H & E, la cartilagine articolare, l'osso subcondrale e il menisco sono stati visualizzati con sei volte l'ingrandimento e 40 volte l'ingrandimento. Allo stesso modo, le sezioni dei tessuti molli macchiate di H & E, il cuscinetto di grasso infrapatellare, il legamento crociato anteriore, la sinovia e il muscolo obliquo vastus medialis sono stati visualizzati a sei volte l'ingrandimento e poi a 40 volte l'ingrandimento.
La valutazione della qualità dell'RNA estratto ha indicato la presenza di campioni di alta qualità basati su integrità, resa e purezza, nonché campioni di bassa qualità, suggerendo che, nonostante l'utilizzo di un metodo ottimizzato, fattori esterni come la gravità della malattia possono influire sulla qualità dell'RNA su diversi tessuti dello stesso paziente. La corretta identificazione di ciascun tipo di tessuto è necessaria per consentire confronti intra e intersettoriali all'interno e tra i campioni dei pazienti, soprattutto data la notevole eterogeneità dei tessuti della malattia primaria. Le tecnologie di sequenziamento sono in rapida evoluzione e l'isolamento di RNA di alta qualità è un prerequisito fondamentale per l'utilizzo di queste tecnologie per svelare i meccanismi tessuto-specifici sottostanti in malattie complesse e croniche come l'osteoartrite.
