Qui, presentiamo il protocollo per l'uso dell'etanolo come solvente per estrarre e caratterizzare la propoli verde taiwanese che inibisce l'attività antibatterica. Questo protocollo è un metodo affidabile e ripetibile per determinare la qualità della propoli verde taiwanese. A dimostrare la procedura saranno Chun'Ting Chen e Yi'Hsuan Chien, dottorandi del mio laboratorio.
Per iniziare, pesa 100 grammi di propoli verde taiwanese. Usando una smerigliatrice di spezie, macinare la propoli assicurandosi che i pezzi siano macinati in una polvere fine senza particelle di grandi dimensioni. Impostare cinque contenitori e aggiungere 100 millilitri di varie concentrazioni di etanolo in acqua a ciascuno.
Mescolare 10 grammi di propoli macinata nella soluzione di etanolo in ogni pallone e incubare a 25 gradi Celsius con scuotimento a 250 giri/min per 48 ore. Successivamente, utilizzare carta da filtro con una dimensione dei pori di 25 micrometri per filtrare gli estratti di etanolo. Utilizzando un pallone volumetrico, ricostituire i filtrati al loro volume originale di 100 millilitri con 95% di etanolo.
Conservare gli estratti ricostituiti a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'uso. Quando sei pronto a preparare gli estratti per HPLC, usa l'evaporazione sottovuoto per concentrare 10 millilitri di ogni estratto a 40 gradi Celsius per 10 minuti. Cuocere la sostanza secca a 45 gradi Celsius per 24 ore.
Quindi, ricostituire ogni campione di sostanza secca con 10 millilitri di etanolo al 95%. Utilizzando un filtro siringa con una dimensione dei pori di 0,22 micrometri, rifiltrare ogni estratto e raccogliere il filtrato per l'analisi diretta con HPLC. Per iniziare a stabilire una curva standard, preparare un litro della soluzione di metanolo e acqua di fase mobile con un rapporto tra 88,8 e 11,2.
Utilizzando la soluzione di fase mobile come solvente, preparare diluizioni seriali delle concentrazioni standard di propolina come delineato nel protocollo di testo. Iniettare 20 microlitri di ogni concentrazione standard nelle colonne in fase inversa in sequenza dalla concentrazione più bassa alla più alta. Quindi, impostare la colonna HPLC su 30 gradi Celsius, impostare la lunghezza di rinuncia del rilevatore UV su 280 nanometri e la portata su un millilitro al minuto e il tempo del registratore su 20 minuti.
Analizzare gli standard almeno tre volte. Successivamente, utilizzare il software della scheda di calcolo per collegare la risposta di misurazione alla concentrazione risultante in una curva standard con un'equazione determinata e un valore R al quadrato. Per iniziare ad analizzare gli estratti, iniettare 20 microlitri di ogni estratto nella colonna di fase inversa.
Impostare la colonna HPLC su una temperatura di 30 gradi Celsius e una portata di un millilitro al minuto. Impostare la lunghezza di rinuncia del rilevatore UV su 280 nanometri e il tempo del registratore su 20 minuti. Analizzare gli estratti almeno tre volte.
Quindi, utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di propolina in ogni estratto di etanolo. Dopo aver preparato gli organismi di prova e gli estratti di etanolo, aggiungere 10 microlitri di estratto diluito di etanolo, che vanno da 0,156 a 640 microgrammi per millilitro nei pozzi di una piastra di 96 pozzetti. Utilizzare brodo per regolare il volume in ogni pozzo a 100 microlitri assicurandosi di mantenere il 5% di DMSO in tutte le diluizioni.
Successivamente, inoculare 100 microlitri di coltura batterica in ogni pozzo della piastra del pozzo 96. Cultura a 37 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzare un lettore di micropiastrine a 590 nanometri per analizzare la crescita batterica in base alla torbidità e determinare la concentrazione inibitoria minima.
Successivamente, inoculare 10 microlitri di coltura liquida da ogni pozzo che mostrava alla crescita su una piastra di agar. Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Identificare la concentrazione più bassa che non ha rivelato una crescita batterica visibile per determinare l'attività batterica.
La concentrazione che ha completamente eliminato la crescita cellulare è considerata la concentrazione batterica minima. In questo studio, la propoli verde taiwanese viene estratta con etanolo. La resa di sostanza secca sembra essere più alta quando si utilizza un'alta concentrazione di etanolo e più bassa quando si utilizza acqua.
Questi risultati indicano che un solvente organico funziona meglio durante questa estrazione e che la resa è positivamente associata alla concentrazione di etanolo. Allo stesso modo, la concentrazione di propolini sembra essere positivamente associata alla concentrazione di etanolo durante l'estrazione, con la più alta resa di propolini ottenuta negli estratti di etanolo del 95% e del 99,5%. Vengono quindi studiati gli effetti antibatterici degli estratti di etanolo contro l'aureo S e l'E coli.
La concentrazione minima media inibitoria per S aureus sembra essere compresa tra 10 e 20 microgrammi per millilitro e la concentrazione batterica media sembra essere di 20 microgrammi per millilitro. Gli estratti d'acqua, tuttavia, non hanno avuto alcun effetto antibatterico contro S aureus. Non si osserva alcun effetto antibatterico per l'E coli quando si utilizzano l'acqua o gli estratti di etanolo.
Una delle principali procedure sperimentali è evitare l'uniformità della propoli verde taiwanese durante la macinazione.
