Questo video dimostra una procedura semplificata sviluppata per eseguire studi metabolici sul fegato con sufficiente rigore e riproducibilità, che può servire da guida per eseguire la resezione epatica per i suoi studi di perfusione in vivo. La tecnica è meglio applicata al metabolismo in tempo reale per rilevare la funzione, nei metaboliti di turnover nei modelli di malattia. La perfusione consente un controllo preciso dei nutrienti e degli ormoni disponibili per il fegato.
Sebbene la tecnica non sia diretta verso la terapia, le perfusioni epatiche possono essere strumentali nella comprensione dell'eziologia e dell'impatto di malattie, come il diabete, la NAFLD e la NASH sul metabolismo epatico. Man mano che vengono sviluppati nuovi farmaci, i metodi per valutare il metabolismo energetico centrale epatico diventano essenziali. Questo metodo può essere utilizzato con modelli di diverse malattie, compresi i tumori e in diverse fasi della progressione della malattia.
Per cominciare, posiziona il naso del topo in un cono nasale dopo l'induzione dell'anestesia e fissa le zampe. Somministrare lidocaina attraverso un'iniezione sottocutanea bilateralmente nella regione della cresta iliaca anteriore. Eseguire un test di pizzicamento della punta per confermare l'assenza di tutti i riflessi del dolore.
Eseguire la celiotomia per esporre gli organi interni facendo un'incisione larga tre centimetri. Espandere l'incisione utilizzando un emostato che tira la trazione bloccando il processo xifoide. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per eliminare l'intestino tenue e crasso che copre la vena porta.
Posizionare una sutura di seta sotto l'arco della vena porta prossimale al fegato. Posizionare la seconda sutura di seta prossimale o distale della vena mesenterica inferiore distale dal fegato usando una sutura 2-0. Una volta che le suture sono in posizione, cannulare la vena porta con un catetere calibro 22, mantenendo la smussatura rivolta verso l'alto.
Entra nella vena porta con un angolo non superiore a 15 gradi. Legare la prima sutura oltre il tapper del catetere. Dopo che la vena porta è stata cannulata, ancorare il catetere da due a tre millimetri distali dal ramo della vena porta con la sutura di seta.
Fissare la parte inferiore del catetere con la seconda sutura. Legare un nodo con la sutura per fissare il catetere alla porzione distale della vena porta e al tessuto circostante. Dopo aver fissato il catetere, inserire una siringa da un millilitro con un ago calibro 27 con una lunghezza di 38,1 millimetri nel catetere per lavare il sangue e le bolle d'aria.
Utilizzare un tubo in silicone di un millimetro di diametro interno e cinque millimetri di diametro esterno con un rubinetto di arresto fisso per accoppiare la colonna di perfusione al catetere, consentendo il flusso del tampone nel fegato, segnando l'inizio della perfusione. Dopo aver avviato un timer, alleviare l'aumento della pressione vascolare mediante incisione con le forbici nella vena cava inferiore. Confermare il flusso di perfusare attraverso il fegato osservando il cambiamento omogeneo nel colore del fegato dal rosa o rosso a un giallo pallido.
Una volta confermato il flusso, asportare lo stomaco, l'intestino tenue, l'intestino crasso e il rene destro dal tessuto circostante. Con l'aiuto dell'assistente chirurgico, manovrare il fegato intorno alla cavità addominale e toracica mentre il chirurgo taglia il peritoneo parietale e il tessuto toracico per resecare il fegato. Sollevare il fegato verso l'alto e tagliare i tessuti connettivi rimanenti che tengono il fegato in posizione con le forbici.
Manipolare lentamente il fegato per facilità di visione. Le misurazioni della portata e del consumo di ossigeno sono vitali per monitorare la salute e la funzione del fegato. C'è spesso una leggera differenza nel consumo di ossigeno tra fegati nutriti e a digiuno, che può essere attribuita all'aumento delle richieste di energia imposte dalla glucogenesi nel fegato a digiuno.
I passaggi più importanti includono l'inserimento del catetere con un angolo di 15 gradi, la visualizzazione della punta del catetere, il rotolamento del polso e delle spalle quando si lega la sutura ed evitare la torsione sulla vena porta. Il tessuto asportato può essere studiato dopo la perfusione con qualsiasi numero di approcci biochimici o analitici. Le perfusioni ex vivo in combinazione con la risonanza magnetica e la spettroscopia in tempo reale consentono la misurazione dei flussi metabolici in tempo reale.
Naturalmente, questo si estende alla perturbazione del flusso da uno stato di controllo in risposta alle malattie.
