Lo studio delle proprietà native dei canali ionici utilizzando l'elettrofisiologia patch clamp richiede l'accesso a cellule gravemente isolate. Questo protocollo descrive i metodi per accedere ai singoli miociti cardiovascolari dal pesce zebra in età diverse. Questo protocollo è robusto, semplice, facilmente riproducibile e isola i miociti cardiovascolari dai pesci zebra nel loro stato nativo con una resa e una vitalità relativamente elevate.
Per iniziare, trasferire il pesce in una grande capsula di Petri parzialmente riempita con tampone di perfusione e metterlo sotto un microscopio da dissezione. Tenere il pesce nella mano non dominante con il lato ventrale rivolto verso l'oscilloscopio di dissezione. Con la pinza sottile nella mano dominante, aprire delicatamente i muscoli pettorali e le pinne del pesce per rivelare i tessuti cardiovascolari tra cui atrio, ventricolo e bulbo arterioso.
Tirare delicatamente il bulbo arterioso sulla punta intersecante del bulbo arterioso e dell'aorta ventrale. Separare con cura il bulbo arterioso dall'aorta pizzicando la pinza, localizzando la punta dell'atrio nei rami venosi multipli che convergono. Quindi, strappare la punta dell'atrio dal seno venoso per isolare i tessuti cardiovascolari dal resto del corpo.
Per sezionare i cardiomiociti, estrarre l'atrio e il ventricolo dal tessuto cardiovascolare. Fai una leggera lacrima nel ventricolo usando una pinza fine per drenare il sangue in eccesso, che può essere assicurato quando il tessuto cardiaco passa dal rosso vivo al colore del salmone pallido. Raggruppare l'atrio isolato e il ventricolo in un tubo da centrifuga separato da 1,5 millilitri contenente tampone di perfusione.
Sostituire il tampone di perfusione nei tubi con 750 microlitri di tampone di digestione. Posizionare i tubi su un termoshaker a 37 gradi Celsius e 800 giri al minuto. Consentire la digestione dei tessuti fino a quando non diventano traslucidi.
Terminare la digestione ruotando delicatamente i tessuti in una minicentrifuga da banco a 2.000 volte G per tre-cinque secondi e sostituire il tampone di digestione surnatante con 750 microlitri di tampone di arresto. Sostituire delicatamente il tampone di arresto con 500-750 microlitri di tampone di perfusione e triturare i tessuti 30 volte utilizzando una pipetta Pasteur lucidata a fiamma per disperdere le cellule. Quindi, triturare delicatamente i ventricoli.
Per un campionamento uniforme, pipettare delicatamente le cellule su e giù un paio di volte per risospendere, prima di aggiungerne una goccia per gli studi corrispondenti. Prelevare il bulbo arterioso adulto dai tessuti cardiovascolari e raggruppare cinque bulbo arterioso in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri contenente tampone S1. Sostituire S1 con 400 microlitri di tampone S2 e consentire la digestione della papaina del bulbo arterioso su un termoshaker a 37 gradi Celsius e 800 giri al minuto per 20 minuti.
Lasciare che il bulbo arterioso parzialmente digerito si stabilizzi per un minuto e sostituire il surnatante S2 con 500 microlitri di tampone S3 contenente collagenasi. Digerire i tessuti su un termoshaker a 37 gradi Celsius e 800 giri al minuto per tre-cinque minuti. Terminare la digestione facendo ruotare delicatamente i tessuti in una minicentrifuga da banco a 2.000 volte G per tre-cinque secondi e sostituire il surnatante S3 con 500 microlitri di S1. Triturare delicatamente i tessuti pellettati per disperdere le cellule muscolari lisce vascolari.
Piastra dispersa cellule muscolari lisce vascolari su vetrini di copertura di dimensioni adeguate. Tenere i vetrini di copertura a temperatura ambiente per 30 minuti affinché le celle si attacchino e utilizzarli entro le prossime sei ore. Anestetizzare gli embrioni.
Quindi, concentrare gli embrioni trasferendoli in una provetta da centrifuga da cinque millilitri, quindi rimuovere i mezzi in eccesso. Lavare gli embrioni con tre millilitri di tampone di perfusione fredda due volte, quindi risospenderli in due millilitri di tampone di perfusione. Utilizzando l'apparato di isolamento cardiaco embrionale, aspirare un millilitro di embrioni nell'ago ed espellerli immediatamente nel tubo.
Far passare gli embrioni frammentati attraverso un setaccio a filtro cellulare di 100 micrometri posto in un imbuto. Raccogliere i cuori filtrati in un altro tubo da centrifuga da cinque millilitri. Mescolare bene il filtrato e separare le aliquote da un millilitro in provette da centrifuga da 1,5 millilitri.
Centrifugare tutti i tubi su una minicentrifuga da banco per cinque secondi ed eliminare il surnatante. Effettuare la risospensione seriale dei pellet nei tubi utilizzando un millilitro di tampone di perfusione. Pipettare delicatamente i cuori su e giù due volte prima di aggiungere una goccia per gli studi corrispondenti Per le cellule isolate dal bulbo arterioso, le cellule muscolari lisce vascolari sono state confermate dall'espressione di tagln:EGFP.
Qui sono mostrate tracce rappresentative di registrazioni dell'attività dei canali del potassio sensibili all'ATP da cardiomiociti isolati. Le registrazioni a canale singolo di successo sono state ottenute in cerotti asportati dai cuori embrionali. I miociti ventricolari hanno mostrato potenziali di membrana iperpolarizzati stabili e i potenziali d'azione sono stati stimolati tramite iniezione di corrente attraverso la pipetta patch.
I miociti atriali hanno mostrato un potenziale di azione spontanea. Le proprietà del potenziale d'azione sono riassunte qui. Durante la sostituzione dei tamponi durante la dissociazione dei cardiomiociti, è necessario prestare attenzione che i tessuti digestivi non siano disturbati.
La frammentazione tissutale deve essere ottenuta solo mediante triturazione con pipette. Durante la digestione collagenosa dei tessuti bulbosi, esaminare i tessuti galleggianti, dilatati e traslucidi ogni minuto. Una volta che la frammentazione del tessuto è evidente, cessare la digestione.
Una volta isolate, le cellule possono essere mantenute in vita per ore e utilizzate per l'analisi elettrofisiologica utilizzando tecniche di patch mors. Questo ci ha permesso, ad esempio, di dimostrare che i canali del potassio sensibili all'ATP in questi tessuti zebrafish sono essenzialmente identici a quelli dei mammiferi.
