Protocollo basato sulla microdissezione laser per l'analisi LC-MS/MS del profilo proteomico dei granuli di neuromelanina

La nostra combinazione di microdissezione laser e spettrometria di massa consente lo studio di cambiamenti spazialmente risolti a livello proteomico in qualsiasi tipo di tessuto. Nel nostro caso, granuli di neuromelanina. Il nostro protocollo consente l'analisi proteomica basata su materiale campione limitato.

Che di solito è una grande sfida quando si lavora con tessuto cerebrale postmortem. Poiché le singole cellule possono essere isolate per confrontare condizioni sane e patologiche a livello proteomico. Questo può migliorare la nostra comprensione dei meccanismi della malattia.

Per iniziare, posizionare la slitta della membrana tissutale nel supporto della slitta sul palco del robo con il tessuto rivolto verso l'alto. Per acquisire una scansione panoramica della sezione di tessuto. Utilizzare la funzione di scansione, selezionare l'area di interesse dagli angoli in alto a sinistra e in basso a destra.

Quindi selezionare scansiona tutti i ROI per eseguire la scansione. Per la selezione automatica dei granuli di neuromelanina nel campo visivo corrente. Selezionare l'analisi del campo visivo.

Quindi selezionate Inverti risultato e impostate la soglia per i canali RGB. In modo che solo i granuli di neuromelanina siano evidenziati in rosso nella finestra di anteprima. Ora fai clic su OK per utilizzare le impostazioni regolate per il campo visivo.

Regolare le impostazioni del laser utilizzando un'area della diapositiva coperta solo dalla membrana. Riempire il tappo del tubo di raccolta del campione con 50 microlitri di acqua ultrapura. E inserisci il tappo nel collettore del robo mover.

Utilizzando l'interfaccia software, posizionare il robo mover sopra la fase due del robo per avviare la raccolta dei campioni. Avviare il laser. Controllare le impostazioni di energia e messa a fuoco durante il processo laser e regolare le impostazioni se necessario.

Garantire il corretto isolamento e catapultazione degli oggetti isolati nel tappo del tubo di raccolta dei campioni per almeno i primi 10 oggetti. Al termine del campionamento, guidare il robo mover nella sua posizione iniziale e rimuovere la provetta di raccolta dei campioni. Dopo aver fatto girare i campioni per centratura.

Asciugare i campioni per 1,5 ore in un concentratore sottovuoto. Dopo aver eseguito la digestione triptica come descritto nel testo. Preparare il campione per l'analisi HPLC-MS sciogliendo da 200 a 400 nanogrammi di peptidi campione in un volume definito dello 0,1% TFA.

In ingresso flaconcini di vetro spettrometrico di massa inerte. Se la determinazione della concentrazione non è applicabile a causa di una bassa quantità di campione. Verificare il carico identico del campione confrontando la corrente ionica totale.

Per iniziare l'analisi proteomica dei dati grezzi. Fare clic su Carica per caricare i file raw nel software. Fare clic su imposta esperimento per assegnare i nomi dei campioni.

Per definire parametri specifici del gruppo. Aggiungere le modifiche scegliendo la deamidazione NQ, l'ossidazione M e la carbamidometilazione N-term come modifiche variabili. e quindi aggiungere la carbamidometilazione C come modifica fissa.

Scegli la tripsina come enzima di digestione nella scheda di digestione. Nella scheda di quantificazione senza etichette, aggiungere l'opzione LFQ e se devono essere elaborati più di 10 file, scegliere l'opzione LFQ veloce per ridurre i tempi di elaborazione. Garantire che tutti gli altri parametri specifici del gruppo rimangano nelle impostazioni di fabbrica.

Passare alla scheda parametri globali e aggiungere il file FASTA derivato da uniprot. org nella scheda Sequenze. Modificare di conseguenza la regola dell'identificatore.

E aggiungi l'ID tassonomia 9606 per Homo sapiens. Per la quantificazione delle proteine scegliere peptidi unici e rasoio. Quindi aggiungi l'opzione iBAQ come misura per la quantificazione delle proteine nella scheda di quantificazione senza etichetta.

Assicurarsi che tutti gli altri parametri globali rimangano nelle impostazioni di fabbrica e fare clic su Start. Dopo che l'analisi è stata eseguita con successo recuperare i gruppi proteici. Output txt.

Caricare i gruppi proteici. txt nel software di analisi. Aggiungi i valori iBAQ come colonne principali e ordina tutte le altre colonne in base al loro tipo.

Filtrare le esche e i contaminanti filtrando le righe in base alla colonna categorica e filtrare i risultati in base a valori validi. Esportare l'output in formato txt per ulteriori elaborazioni. E valutare i risultati relativi alla domanda di ricerca.

Nel presente studio, 1.898 gruppi proteici sono stati identificati in NMG e 1.565 sono stati identificati nel tessuto SN circostante di cui 1.384 sono stati identificati in entrambe le aree tissutali. Pertanto, 514 e 181 gruppi proteici sono stati identificati esclusivamente nei NMG e nel tessuto SN rispettivamente. Nelle misurazioni rappresentative DDA.

Valori di iBAQ leggermente più alti negli NMG rispetto a SN indicavano una maggiore abbondanza della proteina citoplasmatica dinien-1, catena pesante 1 negli NMG. Questa osservazione potrebbe essere verificata in esperimenti PRM per il peptide ESPEVLLTLDILK. In cui è stata rilevata una maggiore abbondanza di NMG.

In base all'area di picco a livello MS1 e MS2. Il passo più importante è di gran lunga l'isolamento degli NMG, poiché il resto del protocollo si basa su questo passaggio da eseguire correttamente. Dopo la procedura LMD, i campioni possono essere utilizzati e ulteriormente elaborati per qualsiasi tipo di tecnica omica come genomica, trascrittomica, proteomica o lipidomica.