Questa tecnica consente di osservare lunghi processi biologici in camere di uova di Drosophila sezionate, come la migrazione nucleare degli ovociti, utilizzando la microscopia di imaging dal vivo. Questo protocollo descrive come mantenere in vita le camere delle uova sezionate per 12 ore per eseguire la microscopia di imaging dal vivo. Per iniziare, pipettare 200 microlitri di Schneider Medium e integrare con 30 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di insulina, quindi aggiungere quattro microlitri di siero fetale di vitello inattivato dal calore.
Utilizzare una punta della pipetta per applicare una piccola quantità di grasso siliconico intorno al foro sul lato inferiore della diapositiva forata. Posizionare un coverslip e utilizzare l'estremità larga di una punta della pipetta per applicare pressione sul coverslip per appiattire il grasso siliconico per creare un anello in silicone interno alla diapositiva. Trasferire le mosche femminili anestetizzate nel pozzo di dissezione contenente 150 microlitri del mezzo di imaging.
Per sezionare la femmina, utilizzare la pinna per afferrare il torace e pizzicare la cuticola dell'addome dorsale con un secondo paio di pinci. Rimuovere con cura l'utero, l'ovidotto e la guaiina muscolare. Isolare e staccare la coppia di ovaie visibili all'apertura della cuticola.
Posizionare una goccia da 10 a 15 microlitri del mezzo di imaging sulle ovaie e trasferire un'ovaia nella camera di imaging. Per separare gli ovarioli, utilizzare l'ago per tenere l'estremità posteriore dell'ovaio. Utilizzare un altro ago per tirare con cura il germarium per stuzzicare gli ovarioli a parte.
Tenere la guaina con un ago e tirare l'ovariole attraverso le camere più grandi con un altro ago per rimuovere la guaina muscolare rimanente sulle camere dell'uovo. Lasciare affondare l'ovariole non infessato e contattare il coperchio. Rimuovere le fasi tardive e il resto delle ovaie dalla microcamera usando una pinica.
Utilizzare aghi per distanziare attentamente gli ovarioli per facilitare l'acquisizione. Tagliare un piccolo quadrato di 10 per 10 millimetri della membrana permeabile. Applicare con attenzione la membrana sulla parte superiore del mezzo di imaging per espellere eventuali bolle d'aria.
Quindi sigillare ermeticamente la camera con un sottile strato di olio di alocarburi attorno al pozzo sul contorno della membrana. Posizionare la configurazione dell'immagine sul supporto del vetrino del microscopio invertito e utilizzare un obiettivo 40X. La migrazione del nucleo ovocitario di una camera di uova wild type è stata catturata utilizzando la microscopia di imaging dal vivo.
Il nucleo raggiunge la membrana plasmatica anteriore o la membrana plasmatica laterale prima di scivolare lungo le traiettorie per raggiungere la sua posizione finale all'intersezione delle due membrane plasmatiche. Deformità di membrana, cellule follicolari disorganizzate, cellule rachitiche e nuclei rimpiccioliti sono i primi segni di camere d'uovo morenti. L'ovocita degenerato prima di otto ore di imaging di solito non viene rilevato.
Tuttavia, rari casi di degenerazione precoce sono dovuti a problemi durante la dissezione o le fasi di montaggio. Danneggiare le camere delle uova compromette la loro sopravvivenza. Quindi la delicata dissezione precisa a mano e la preparazione della microcamera sono fondamentali.
Questa procedura ci ha permesso di visualizzare che il nucleo dell'ovocita può prendere tre diverse traiettorie durante la sua migrazione e diversi organelli regolano queste traiettorie all'interno dell'ovocita.
